甲型H1N1流感病毒HA基因與沙門菌flj B基因的融合表達與鑒定＊

楊 蕓，潘志明，馬全剛，張 磊，康喜龍，耿士忠，焦新安

目前，國內外對甲型H1N1流感的防治主要采用滅活裂解疫苗進行免疫預防，效果確實，在疾病的防治中發揮了巨大的作用［1］。但是滅活苗也存在一些缺陷，如不能有效激發細胞和黏膜免疫應答等［2］。因此，有必要研究一種安全、高效的新型甲型H1N1流感疫苗以彌補上述不足。

血凝素（hemagglutinin，HA）是流感病毒的一種主要保護性抗原，誘導中和抗體。HA裂解為HA1和HA2兩個亞基，這兩個亞基通過一個二硫鍵連接。HA1亞基參與細胞受體結合，HA2亞基則在病毒與細胞膜融合中起主要作用［3］。

研究顯示，鞭毛蛋白被細胞TLR5（Toll－like receptor 5，TLR5）分子識別后，激發機體產生先天性免疫應答，繼而啟動并促進針對外源抗原的獲得性免疫應答，包括體液免疫、細胞免疫以及局部黏膜免疫，顯示出鞭毛蛋白免疫佐劑的特性［4－5］。鞭毛蛋白由D0、D1、D2、D3四個功能區域構成，其中D1區域是高度保守區域，含有TLR5結合位點，D2和D3則構成其高變區［6］。研究表明抗原序列插入鞭毛蛋白的末端或高突變區，都不會影響TLR5信號途徑，但是這些插入位點對抗原序列具有選擇性［7］。

本實驗將 A/California/05/2009 H1N1 HA片段 HA1－2（K62－S284）通過柔性肽連接到鼠傷寒沙門菌Ⅱ型鞭毛蛋白的N端，利用大腸桿菌原核表達系統表達出融合蛋白，以期為新型甲型H1N1流感疫苗的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、載體和細胞 鼠傷寒沙門菌SL7207、宿主菌E.coliDH5α、表達菌E.coliBL21（DE3）、表達載體p ET30a（＋）均由江蘇省人獸共患病學重點實驗室保存，HEK293－m TLR5細胞由美國貝勒醫學院李毅教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 His·BindTMPurification Kit購自Novagen公司，ProteoSpin Endotoxin Removal kit micro for protein ＆peptides購自Norgren公司，Human IL－8 ELISA kit購自Excell公司，DNA片段快速純化/回收試劑盒購自百泰克生物科技有限公司，質粒DNA抽提試劑盒購自TIANGEN生物科技有限公司，DMEM培養基、胎牛血清（FBS）購自Gibco○R公司，卡那霉素、T4 DNA連接酶、高保真Taq酶、EcoRⅠ、XhoⅠ、DL2000 DNA Marker、λ－Eco T14 digest DNA Marker、IPTG 等購 自寶生物工程（大連）有限公司，HRP－羊抗鼠IgG抗體購自Sigma公司，HA1－2蛋白、鞭毛蛋白、含有甲型H1N1流感病毒HA基因的重組質粒p ET－HA［8］、小鼠抗H1N1 HA蛋白和鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白多抗血清均由江蘇省人獸共患病學重點實驗室制備。

1.1.3 引物的合成和DNA的測序 基因擴增引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，重組質粒DNA的測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因 HA1－2－flj B的構建

1.2.1.1 引物的設計與合成 根據Gen Bank中鼠傷寒沙門菌SL7207基因組中flj B基因序列設計引物 fljB－F，fljB－R。 上 游 引 物 fljB－F：5′－GTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCATGGCACAAG TAATCAACAC－3′， 下 游 引 物 fljB－R： 5′－CCGCTCGAGTTAACGTAACAGAGACAGC－3，（XhoⅠ酶切位點）。以含有甲型H1N1流感病毒HA基因的重組質粒p ET－HA為模板，設計合成一對引物，用于HA1－2基因的PCR擴增。上游引物HA1－2－F：5′－CCGGAATTCAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGG－3′（EcoRⅠ酶切位點），下游引物 HA1－2－R：5′－CACCGCCGCTTCCACCGCCACCAATGATAATACCAG－3′。

1.2.1.2 目的基因 HA1－2－flj B的克隆及鑒定以鼠傷寒沙門菌SL7207基因組為模板，fljB－F、fljB－R為引物擴增flj B基因。PCR擴增條件是：94℃預變性5 min；94℃變性50 s、50℃退火50 s、72℃延伸1.7 min，共30個循環；72℃終延伸10 min。以 重 組 質 粒 p ET－HA 為 模 板，HA1－2－F、HA1－2－R 為 引 物，PCR 擴 增 HA1－2 基 因 片 段。PCR擴增條件是：94℃預變性5 min；94℃變性50 s、50.5℃退火50 s、72℃延伸1 min，共35個循環；72℃終延伸10 min。再以上述兩種PCR產物為模板，HA1－2－F、fljB－R為引物通過overlap PCR 拼接和擴增 HA1－2－flj B基因片段，預期片段大小為2 208 bp。PCR擴增條件是：94℃預變性5 min；94℃變性50 s、55℃退火50 s、72℃延伸2.2 min，共30個循環；72℃終延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.2 原核表達質粒p ET－HA1－2－flj B的構建及鑒定 將PCR產物和原核表達載體p ET30a（＋）用EcoRⅠ，XhoⅠ雙酶切后回收，連接、轉化E.coliDH5α感受態細胞，卡那霉素篩選陽性克隆，提取陽性克隆質粒雙酶切和測序鑒定。將測序正確的重組質粒命名為p ET－HA1－2－flj B。

1.2.3 融合蛋白 HA1－2－fljB的表達及純化 將重組質粒p ET－HA1－2－flj B轉化宿主菌E.coliBL21（DE3），構建重組菌E.coliBL21（DE3）（pETHA1－2－flj B），重組菌接種于含50μg/m L卡那霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，繼續在37℃條件下振蕩培養，誘導表達5 h。誘導產物裂解后離心，分別將誘導產物裂解上清及沉淀進行SDS－PAGE分析，判斷融合蛋白的可溶性。按上述方法對陽性克隆進行大量誘導表達，離心收集菌體，無菌PBS重懸菌體，超聲波裂解，離心收集上清，His·Bind○RPurification Kit純化后，于－70℃保存備用。

1.2.4 Western blotting分析 將誘導表達的融合

蛋白 HA1－2－fljB經SDS－PAGE電泳后，轉印到硝酸纖維素膜（NC）膜上，用含1%小牛血清的PBST室溫作用過夜，次日用PBST洗滌4次后，將NC膜分為2組，分別以小鼠抗H1N1 HA和鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白多抗血清（均以1∶4 00稀釋）室溫孵育4 h，充分洗滌后以 HRP－羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋）室溫孵育2 h，PBST洗滌4次后，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蒸餾水終止反應。

1.2.5 TLR5生物學試驗 目的蛋白刺激HEK293－m TLR5細胞，檢測IL－8的分泌水平，評價目的蛋白的TLR5活性。每孔100μL含5×104個細胞置于96孔板中培養過夜。次日，將鞭毛蛋白、HA1－2 蛋 白、融 合 蛋 白 HA1－2－fljB 用 ProteoSpin Endotoxin Removal Micro Kit for proteins＆peptides去除內毒素后，分別以5 pg/μL濃度刺激細胞5 h。收集上清，用Human IL－8 ELISA kit檢測IL－8分泌水平。

2 結 果

2.1flj B、HA1－2和 HA1－2－flj B基因的擴增flj B、HA1－2和 HA1－2－flj B基因 PCR 擴增 產 物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在1521、669和2208 bp處出現特異性條帶，與預期的基因片段大小相符（圖1、2）。說明成功擴增出 HA1－2－flj B目的基因片段。

圖1 flj B和HA1－2基因PCR產物電泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR amplified fljB and HA1－2 geneM：DL 2000 DNA marker；1：PCR products of fljB gene；2：PCR products of HA1－2 gene

2.2 原核表達質粒p ET－HA1－2－flj B的構建與鑒定 用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切 HA1－2－flj B基因片段和p ET30a（＋）表達質粒，電泳回收相應的目的基因片段和p ET30a（＋）片段，T4 DNA連接酶連接，構建重組質粒p ET－HA1－2－flj B，并將提取的重組質粒轉化，再將提取的質粒經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，獲得2208 bp大小的目的基因片段和5400 bp大小的載體片段（圖3），表明重組質粒p ETHA1－2－flj B構建成功。

2.3 融合蛋白 HA1－2－fljB 的表達及純化 SDSPAGE分析重組菌E.coliBL21（DE3）（p ET－HA1－2－flj B）的表達產物顯示，在84 k D左右處出現一明顯的新生蛋白條帶，其大小與預期蛋白大小一致（圖4），表明成功表達出融合蛋白 HA1－2－fljB，并主要存在上清（圖略），且純化后的表達產物只有一特異性條帶（圖4）。

2.4 Western blotting分析結果 融合蛋白經SDS－PAGE分析后轉移至NC膜，用小鼠抗鞭毛蛋白多抗血清和抗H1N1 HA多抗血清作為一抗分別對融合蛋白進行Western blotting分析，NC膜上均出現了目的條帶，大小均與SDS－PAGE表達的蛋白大小一致（圖5）。表明融合蛋白HA1－2－fljB具有良好的免疫反應性。

2.5 融合蛋白HA1－2－fljB的TLR5生物活性 體外ELISA試驗檢測IL－8分泌水平，評價鞭毛蛋白激活TLR5的能力。與陽性對照鞭毛蛋白（fljB）相比，融合蛋白HA1－2－fljB能誘導細胞分泌高水平的IL－8（1 220 pg/m L），而 HA1－2蛋白刺激組分泌極低水平的IL－8（40 pg/m L）（圖6）。

3 討 論

近年對基于鞭毛蛋白的融合蛋白與鞭毛蛋白和抗原的聯合免疫效果比較研究發現，前者更能有效促進抗原特異性的免疫應答，因為CD11c＋抗原提呈細胞TLR5高親和力結合鞭毛蛋白而攝取抗原；TLR5信 號 能 促 進 樹 突 狀 細 胞 激 活［9－10］。Steven等［7］比較總結多種基于鞭毛蛋白的融合蛋白的免疫效果后，認為鞭毛蛋白N末端是一個較好的設計位點。 據 此，本 文 選 擇 將 A/California/05/2009 H1N1的HA片段HA1－2連接到鼠傷寒沙門菌Ⅱ型鞭毛蛋白fljB的N端。首先在設計下游引物HA1－2－R時引入柔性肽（Gly4Ser）3上游序列，上游引物fljB－F時引入柔性肽（Gly4Ser）3下游序列，然后通過overlap PCR技術將HA1－2和flj B基因連成融合基因 HA1－2－flj B，最終以原核系統表達HA1－2－fljB融合蛋白。

圖6 不同蛋白的TLR5活性Fig.6 TLR5 activity of different proteins

本實驗中，SDS－PAGE結果顯示在84 k D左右處出現一較濃的條帶，表明融合蛋白獲得高效表達。Western blotting結果顯示融合蛋白能識別A/California/05/2009 H1N1 HA蛋白多抗血清中的特異抗體，表明該融合蛋白中HA1－2片段具有良好的免疫反應性。理論上HA基因的表達需要宿主細胞的翻譯后修飾，因此通常選擇用真核細胞系制備HA蛋白［11］，但研究發現HA蛋白的糖苷化不影響抗體應答，細菌表達系統也能表達保護性HA亞基［11－12］。本實驗結果與此結論一致。另外 Western Blotting結果也顯示出融合蛋白能與抗鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白多抗血清中的特異抗體發生反應，表明其鞭毛蛋白部分也具有較好的免疫反應性。

TLR5識別其配體鞭毛蛋白，啟動銜接分子My D88募集IL－1受體相關激酶（IRAK），IRAK磷酸化被活化，結合TRAF6，激活NF－κB信號途徑，最終調節IL－8［13－14］基因的轉錄翻譯，所以檢測IL－8的表達可以作為TLR5被鞭毛蛋白激活的標志，從而評價融合蛋白HA1－2－fljB中鞭毛蛋白基因是否獲得正確表達。TLR5生物試驗結果顯示，鞭毛蛋白與融合蛋白均能強烈誘導HEK293－m TLR5分泌IL－8，而單獨的 HA1－2蛋白誘導IL－8的分泌水平幾乎與空白對照相同，表明融合蛋白具有激活TLR5的生物學功能。

本實驗成功表達出融合蛋白，為進一步研究其免疫原性及H1N1甲型流感疫苗奠定了基礎。此外利用大腸桿菌表達系統表達蛋白的方法不僅快速方便、成本低廉，而且能獲得高水平蛋白，為甲型流感疫苗的大量有效制備技術提供了一條新途徑。

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