Taq Man－MGB熒光定量PCR快速檢測結核分枝桿菌katG基因突變＊

潘愛珍，趙秀芹，張媛媛，王曉萌，柳正衛，萬康林

2.浙江省疾病預防控制中心，杭州 310051

近年來，結核病耐藥問題已成為全球公共衛生關注的焦點，尤其是耐多藥和廣泛耐藥。異煙肼作為常用的一線抗結核藥物，對病人的治療發揮重要作用。全球范圍內，異煙肼總耐藥率13.3%，初治結核病例耐藥率10.3%，復治病例耐藥率27.7%；在我國，異煙肼總耐藥率18.96%，初治結核病例耐藥率16.01%，復治病例耐藥率38.51%，各項均高于全球水平［1］。因此對異煙肼耐藥性快速診斷很有必要。

研究表明，結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的產生與katG、inh A、kasA、ahp C和ndh等多基因的突變相關［2］，但60%～70%的耐藥株是由于katG基因第315位密碼子突變所致［3］，且這一突變與高耐藥量密切相關［4］。因此，katG基因是異煙肼耐藥性檢測的首選基因。本研究的目的是針對常見異煙肼耐藥位點katG315建立Taq Man－MGB熒光定量PCR技術，以達到快速診斷結核分枝桿菌異煙肼耐藥，為臨床提供及時有效的化療指導。

1 材料與方法

1.1 陽性對照標準株 FAM－MGB野生型陽性標準菌株H37Rv，購自中國藥品生物制品檢定所。HEX－MGB突變型陽性標準菌株FJ07063，katG315 G→C，背景明確且穩定的菌株。由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病室傳代培養、保藏。

1.2 實驗菌株 130株結核分枝桿菌臨床分離株均由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病室提供，包括71株結核分枝桿菌臨床分離株katG315位點測序結果為野生型G，57株315位密碼子G→C，2株315位密碼子G→A。

1.3 16株非結核分枝桿菌標準株 鳥分枝桿菌95001、胞內分枝桿菌95002、蟾分枝桿菌95003、施氏分枝桿菌95008、堪薩斯分枝桿菌95013、海分枝桿菌95014、猿分枝桿菌95015、瘰疬分枝桿菌95017、戈登分枝桿菌95018、龜分枝桿菌95020、膿腫分枝桿菌95021、偶發分枝桿菌95022、恥垢分枝桿菌95023、東海分枝桿菌95038、灰塵分枝桿菌95040、南非分枝桿菌95044。均由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病室傳代培養、保藏。

1.4 7種常見呼吸道感染細菌的標準株核酸提取物 金黃色葡萄菌株、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯、肺炎衣原體、百日咳、化膿鏈球菌、肺炎支原體，分別由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所呼吸道室、診斷室提供。

1.5 主要儀器與試劑 熒光Line－Gene K、DNA自動擴增儀，杭州博日科技有限公司；凝膠成像系統，英國 Uvi公司。TIANprep Mini Plasmid kit（質粒提取試劑盒）、TIANgel Mini Purification kit（膠回收試劑盒），天根生物工程公司；p MD18－T載體、感受態細胞E.coliJM109，Ta KaRa公司。BioEasy Taq Man PCR Magic Mix，杭州博日科技公司。

1.6 結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌菌株DNA的提取，方法見文獻［5］。

1.7 引物和探針 根據katG315突變位點設計引物和特異性探針，見表1。引物和探針由上海基康生物技術有限公司合成。

表1 引物和探針序列Tab.1 Primers and probes sequences

1.8 熒光PCR條件參數優化katG基因單通道或雙通道Taq Man實時PCR實驗參數的優化主要包括上下游引物濃度的優化、探針濃度和退火溫度的優化。用H37Rv和FJ07063優化熒光PCR體系。根據CT值和熒光值并結合節省試劑的原則來判斷優化的條件。

1.9 PCR體系和條件 常規PCR體系（40μL）：上下游引物（10μmol/L）各1.5μL，Pre－mix 20μL，去離子水15μL，模板2μL。循環參數為94℃ 預變性2 min；94℃變性30 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，共35個循環；72℃延伸5 min。雙通道熒光PCR體系（20μL）：Taq Man PCR－mix 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，雙探針（10μmol/L）各0.4μL，Taq polymerase 0.15μL，去離子水5.45μL，模板2μL。循環參數為94℃ 預變性2 min；94℃變性10 s，退火60℃40 s，共40個循環；在60℃退火溫度時收集熒光信號。產物于2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統下觀察結果。

1.10 陽性標準品的構建和標準曲線的制備 常規PCR反應體系和條件分別擴增H37Rv和FJ07063。PCR產物膠回收后克隆入p MD18－T載體轉化到感受態細胞EcoliJM109內。抽提質粒并進行驗證，經濃度測定和拷貝數換算，進一步稀釋陽性標準品制備標準曲線。

1.11 特異性檢測 熒光PCR檢測16種非結核分枝桿菌的標準株和7種常見呼吸道感染細菌的標準株核酸提取物，評價方法的特異性。

1.12 最低檢測下限檢測 熒光PCR與常規PCR法分別擴增10倍稀釋梯度陽性標準品作最低檢測下限比較

1.13 穩定性檢測 用標準品 H37Rv（1.0×106copies/μL）分兩批隔兩天連續進行10次熒光PCR反應擴增，觀察批內和批間CT值變化以檢測其穩定性。同時對H37Rv不同拷貝數標準品 （1.0×107copies/μL、1.0×105copies/μL、1.0×103copies/μL）進行熒光PCR反應擴增，每種濃度作雙孔平行檢測，觀察其CT值變化以檢測其穩定性。

1.14 質量控制和診斷標準 每次擴增均以H37Rv，FJ07063作為陽性對照，以雙蒸水代替模板為陰性對照。CT≤37，有典型熒光S型曲線為陽性，CT＞37為陰性。所有菌株都設有雙孔平行檢測。

2 結 果

2.1katG基因單通道Taq Man實時PCR實驗參數的優化。

2.1.1 引物濃度的優化 先將探針濃度固定在200 nmol/L，退火溫度60℃，選擇引物終濃度在100～800 nmol/L之間優化，根據CT值小、熒光信號較強并結合節省試劑的原則，確定最佳引物濃度FAM 通道為400 nmol/L，HEX通道為500 nmol/L，見表2。

表2 不同引物濃度下FAM、HEX單通道的CT值Tab.2 FAM，HEX single channel CT value in different primer concentration

2.1.2 探針濃度優化 根據2.1.1的結果，引物濃度FAM通道固定在400 nmol/L，HEX通道固定在500 nmol/L，退火溫度60℃，選擇探針終濃度在100～400 nmol/L之間優化，根據優化原則，確定最佳探針濃度FAM通道為200 nmol/L，HEX通道為300 nmol/L，見表3。

表3 不同探針濃度下FAM、HEX單通道的CT值Tab.3 FAM and HEX single channel CT value in different probe concentration

2.1.3 單通道退火溫度優化 根據2.1.1和2.1.2的結果，固定引物和探針濃度，退火溫度從54℃～64℃以2℃上升梯度優化，最后確定最佳退火溫度為58℃。

2.2katG基因雙通道Taq Man實時PCR實驗參數的優化

2.2.1 雙通道引物和探針優化 考慮到雙通道兩種探針相互干擾的可能性，按照單通道優化的結果通過3種方案來優化雙通道引物和探針參數，見表4。最終確定上游引物終濃度400 nmol/L，下游引物終濃度400 nmol/L，探針P1終濃度200 nmol/L，探針P2終濃度200 nmol/L。

A：F、R：450Nm，PW、PM：250Nm；B：F、R：450Nm，PW：200 Nm，PM：300Nm；C：F、R：400 Nm，PW、PM：200Nm；＊為優化值

2.2.2 雙通道退火溫度優化 在2.2.1優化基礎上，退火溫度從56℃～62℃以2℃上升梯度優化，最終確定60℃為退火溫度。

2.3 制備陽性標準品

2.3.1 陽性克隆子驗證 對挑選出的克隆子進行常規PCR擴增，均得到目的基因片段122 bp，證明是陽性克隆子，見圖1。PCR鑒定陽性后，對提取的克隆質粒測序，經與已知目的序列進行BLAST比較，證明重組質粒序列正確。

2.3.2 質粒拷貝數的計算以及質粒的倍比稀釋質粒H37Rv和FJ07063的DNA做3次濃度測定平均值分別為47.6 ng/μL，78.8 ng/μL，換算為拷貝數分別為：1.5×1010copies/μL，2.6×1010copies/μL。用雙蒸水將上述質粒依次稀釋成1.0×1010copies/μL－1.0×100copies/μL共11個濃度梯度備用。其中1.0×107copies/μL－1.0×100copies/μL作8個梯度用于做標準曲線。質粒H37Rv和FJ07063的1.0×106copies/μL作為平時檢測菌株的陽性對照。

2.4 最低檢測下限

2.4.1 熒光PCR雙通道最低檢測下限 用梯度稀釋的標準品H37Rv和FJ07063作標準曲線，得知FAM、HEX最低檢測下限為10 copies/μL。雙通道FAM最低檢測下限對應的CT值為35（見圖2），HEX為37（見圖3）。反應體系中標準品拷貝數的對數與相對應的擴增CT值存在一定的線性關系，說明兩者線性相關性好，實驗結果可信，系統誤差較小。

2.4.2 常規PCR最低檢測下限 用相同的引物按照常規PCR的條件和體系擴增以上梯度稀釋的標準品，得到目的片段，見圖4。常規PCR最低檢測下限為1.0×104copies/μL。

圖1 克隆子擴增結果Fig.1 Amplified products of the clones by PCR M：100bp marker；1：H 37 Rv positive control；2：FJ07063 positive control；3：negative control；4：H 37 Rv clone；5：FJ07063 clone

2.5 特異性 熒光PCR檢測16種非結核分枝桿菌和7種常見呼吸道感染細菌，23株菌株雙通道都未出現陽性，探針的特異性100%。

2.6 熒光PCR檢測臨床分離株

2.6.1 130株菌株熒光PCR擴增結果 130株菌株雙通道熒光PCR擴增，野生型探針檢測到71株，突變型探針檢測到57株。有2株菌株雙探針均為陰性。

2.6.2 實驗菌株熒光PCR結果與DNA測序分析比較katG315位點測序結果為G的71株菌株和該位點測序結果為C的57株菌株經熒光PCR分別被野生型和突變型探針準確檢測出，因此無論哪種探針的敏感性和特異性均為100%，陽性預測值和陰性預測值均為100%。其中該位點測序結果為A的2株菌株，野生型和突變型探針均未檢測到。

2.7 熒光PCR體系的穩定性

2.7.1 批內和批間的穩定性 對 H37Rv 1.0×106copies/μL分兩批隔兩天連續進行10次熒光PCR反應，2次批內和1次批間CT值的標準差分別是0.11，0.15，0.14，變異系數為 0.55%，0.76%，0.71%，變異系數小于1%。見表5。

表5 批內和批間CT值比較Tab.5 Comparison of the CT value among Intra and inter test groups

2.7.2 不同濃度的穩定性 對H37Rv不同拷貝數標準品（1.0×107copies/μL、1.0×105copies/μL、1.0×103copies/μL）分別進行熒光PCR反應擴增，每種濃度以雙孔平行檢測。高、中、低拷貝數標準差分別是0.08、0.12、0.20，變異系數分別是0.44%、0.49%、0.65%，變異系數均小于1%。見表6。

表6 在不同拷貝數之間的CT值檢測重復性Tab.6 CT values repeatability test among different concentration of bacterium

3 討 論

本次研究的Taqman－MGB實時熒光PCR能夠在一個封閉的反應體系中同時檢測到只差一個堿基的突變情況，大大減少試驗步驟，實驗時間和對試劑的消耗，在實際應用中有很高的價值。考慮到用不同波長熒光素標記的雙探針（FAM、HEX）可能會有互相的干擾，因此在優化體系時，首先對單通道的引物、探針濃度、退火溫度等參數進行優化，在此基礎上通過3種已優化好的單通道反應體系的引物和探針濃度的各種比例組合來對雙通道的體系優化。以出現CT值越小、熒光值越大和節省成本的原則選擇優化的參數。在優化雙通道時還要考慮到雙探針熒光值差距不能太大。因此選擇了引物、探針終濃度最低的，并且一對引物和兩條探針濃度都是1∶1組合。

評價熒光PCR體系優化的指標有相關系數R2和擴增效率E（E＝10（－1/斜率）－1）。雙通道FAM 的相關系數相關系數 R2＝0.999，擴增效率E＝100.7%，HEX的相關系數R2＝0.999，擴增效率E＝95.3%，均符合優化實驗的標準，實驗結果可信，系統誤差較小。

本研究檢測的任何一份非結核分枝桿菌和常見呼吸道感染細菌標準菌株均未出現陽性，陰性產物經2%瓊脂糖電泳，均未得到預期大小的PCR產物，說明引物和探針特異性強，特異性100%。在確定最低檢測下限時，以能夠產生穩定擴增為依據，即每個濃度梯度雙份平行樣中都出現擴增，且為穩定的CT值，2次的CT值不超過1個循環［6］。本研究實時熒光PCR最低下限均為1×101copies/μL，常規PCR 的最低下限為1.0×104copies/μL，熒光PCR的最低檢測靈敏性是常規PCR的1 000倍。不同濃度同一時間或同一濃度在不同時間內檢測到的結果來評價該體系的穩定性，結果顯示CT值變異系數均小于1%，說明此體系重復性好，穩定性高。

雙探針檢測菌株突變結果與測序結果完全一致，符合率100%，特異性和敏感性均為100%，與Dario［7］等人報道結果一致。敏感性比van Doorn［8］等人（野生型探針70%，突變型探針82%）偏高，可能是因為本研究和Dario的檢測標本是菌株，而van Doorn是痰標本。但特異性均為100%，說明該方法特異性高，與樣本的成分無關。

通過本研究，我們建立了一種可以快速檢測結核分枝桿菌katG基因突變來判斷結核分枝桿菌異煙肼耐藥的Taq Man－MGB熒光定量PCR方法，從DNA提取到發出檢測報告，整個實驗過程只需3 h，與普通PCR相比無需開蓋跑電泳，減少污染，操作簡單。與目前利用基因突變原理檢測結核耐藥的產品Geno Type·MTBDRplus、基因芯片相比，費用相對便宜，實驗消耗時間少。與目前國際上最新的GeneXpert系統相比，費用低，且熒光PCR引物探針設計更加靈活，在我國實際操作性可行性強，是臨床醫生用藥的一種有效快速的輔助手段，為進一步檢測臨床樣本提供可能。

［1］中國人民共和國衛生部.全國結核病耐藥性基線調查報告（2007－2008）［R］.北京：人民衛生出版社，2010，27－37.

［2］Slayden RA，Barry CE.The genetics and biochemistry of isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosis［J］.M icrobe s Infect，2000，2（6）：659－669.

［3］Rattan A，Kalia A，Ahmad N.Multidrug－resistanceMycobacteriumtuberculosis：molecular perspectives［J］.Emerg Infec t Dis，1998，4（2）：195－209.

［4］van Soolingen D，de Haas PE，van Doorn HR，et a1.Mutations at amino acid position 315 of the kat G gene are associated with high－level resistance to isoniazid，other drug resistance，and successful transmission ofMycobacteriumtuberculosisin The Netherlands［J］.J Infect Dis，2000，182：1788－1790.

［5］Embden JD，Cave MD，Crawford JT，et al.Strain identification ofMycobacteriumtuberculosisby DNA fingerprinting：Recommendations for a standardized methodology［J］.Clin Microbiol，1993，31（2）：406－409.

［6］Donald CE，Qureshi F，Burns MJ，et al.An inter－platform repeatability study investigating real－time amplification of plasmid DNA［J］.BMC Biotechnol，2005，5：15.

［7］García de Viedma D，del Sol Díaz Infantes M，Lasala F，et al.New real－time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high－level isoniazid resistance mutations inMycobacteriumtuberculosis［J］.J Clin Microbiol，2002，40（3）：988－995.

［8］Van Doorn HR，Claas EC，Templeton KE，et al.Detection of a point mutation associated with high－level isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosisby using real－time PCR technology with 3＇－minor groove binder－DNA probes［J］.J Clin Microbiol，2003，41（10）：4630－4635.