銀星竹鼠巨噬細胞對馬爾尼菲青霉分生孢子的吞噬作用的實驗研究＊

張 勇，胡永軒，李希清，楊亞波，張軍民，魯 莎，席麗艷

馬爾尼菲青霉病（Penicilliosis marneffei，PSM）是由馬爾尼菲青霉（Penicillium marneffei，P．marneffei）感染引起的地域性深部真菌病，主要在東南亞地區如泰國、越南、印度、老撾、柬埔寨，以及中國廣東、廣西等地流行［1－2］。人感染此病多認為是吸入馬爾尼菲青霉分生孢子引起。多年來一直認為竹鼠可能與人感染馬爾尼菲青霉有關，可能作為馬爾尼菲青霉傳播的貯存宿主［3］。竹鼠（Rhizomyidae；bamboo rats）又名竹貍、竹鼬、冬芒貍、竹根鼠、竹根豬，在動物分類學上屬于脊椎動物亞門、哺乳綱、嚙齒目、竹鼠科、竹鼠屬。其流行分布與馬爾尼菲青霉病流行分布區域大致一致，分布于南亞及東非一帶，我國的竹鼠屬有大竹鼠、中華竹鼠、銀星竹鼠，分布于我國廣東、廣西、云南、福建、湖南、貴州等地［4］。目前從大多數地區野生竹鼠不同組織中均能分離出P．marneffei，文獻報道各地分離率不等，曹存巍等人對廣西43只野生銀星竹鼠進行研究發現馬爾尼菲青霉分離率達100%，而李希清等對廣東地區野生竹鼠的研究表明馬爾尼菲青霉分離率為70%［5－6］；其中常見分離部位為肺、脾臟、肝臟、淋巴結、腸系膜等［5－6］，但是竹鼠多未表現出臨床感染癥狀，組織病理改變輕微［7］。到目前為止，竹鼠在馬爾尼菲青霉傳播途徑中的作用與地位尚不明確。

本研究擬從銀星竹鼠常見的能分離出馬爾尼菲青霉的組織部位獲得原代巨噬細胞，并進行初步鑒定，了解巨噬細胞對馬爾尼菲青霉分生孢子的吞噬情況，探討不同組織部位在細胞水平與馬爾尼菲青霉的相互關系，為進一步研究竹鼠與馬爾尼菲青霉及馬爾尼菲青霉病的相互關系提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 銀星竹鼠購自廣東從化某野生竹鼠馴化養殖場。

1．2 主要試劑與儀器 Dulbecco＇s Modified Eagle’s Medium （DMEM）、Fetal bovine serum（FBS）為Gibco產品，瑞氏－吉姆薩染液、綠色熒光素5－FITC為美國AnaSpec產品，紅細胞裂解液購自普利萊基因技術有限公司，其它試劑為生化常用試劑。二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡及照相系統為孫逸仙紀念醫院醫學研究中心提供，透射電鏡為廣州軍區廣州總醫院提供。

1．3 巨噬細胞分離培養

1．3．1 肺泡巨噬細胞分離培養 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉竹鼠后，用75%酒精浸泡3～5 min。參考文獻［8－9］，采用支氣管肺泡灌洗的方法獲得肺泡巨噬細胞。4℃離心（1 500r／min）10min，棄上清液。加入5mL含10%FBS的DMEM培養基重懸細胞，0．4%臺盼藍染液染色2～3min，鏡下觀察藍染細胞比例，然后再高倍鏡下細胞計數，并調整細胞濃度為2×106個／mL。分裝至培養瓶或培養板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內孵育。2～2．5h后，棄去非貼壁細胞，貼壁細胞即為巨噬細胞，加入新的含10%FBS的DMEM培養基繼續培養備用。

1．3．2 腹腔巨噬細胞分離培養 參照文獻［8，10］所述方法，采用乙醚吸入法麻醉竹鼠后，用75%酒精浸泡3～5min，腹腔注入4℃預冷PBS 50～100 mL，仰臥并輕揉竹鼠腹部2～3min，回抽并收集腹腔沖洗液。離心及純化等過程與肺泡巨噬細胞的收集步驟相同。

1．3．3 脾臟巨噬細胞分離培養 無菌條件下手術分離脾臟，剪成1mm×1mm組織塊，4℃預冷PBS洗滌3次，DMEM培養基洗滌2次，機械研磨組織塊，200目不銹鋼網過濾2次，獲得脾臟組織混懸液（主要含紅細胞、淋巴細胞、巨噬細胞），紅細胞裂解液裂解去除紅細胞后PBS洗滌2次，DMEM培養基洗滌1次。分裝至培養瓶或培養板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內孵育。1．5h后，棄去非貼壁細胞，貼壁細胞即為巨噬細胞，加入新的含10%FBS的DMEM培養基繼續培養備用［8，11－12］。

1．4 細胞形態學觀察

1．4．1 瑞氏－吉姆薩染色 每日用倒置相差顯微鏡觀察貼壁細胞的形態及生長狀況。將培養2d的巨噬細胞，制成細胞爬片，按試劑說明書進行細胞染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1．4．2 透射電鏡觀察 使用細胞刮子刮下培養3d的貼壁巨噬細胞，PBS洗滌2次，離心后棄上清，細胞沉淀用4%的戊二醛固定過夜。按照透射電鏡超薄切片制作方法進行系列脫水、包埋、制作超薄切片，透射電鏡下觀察。

1．5 吞噬功能檢測

1．5．1 透射電鏡觀察巨噬細胞吞噬馬爾尼菲青霉分生孢子 參考文獻［13］獲得馬爾尼菲青霉分生孢子懸液，按5∶1比例與培養2d的巨噬細胞共培養2h后收集細胞，常規透射電鏡制片并觀察。

1．5．2 流式細胞技術檢測巨噬細胞的吞噬率 將綠色熒光素5－FITC用DMSO配成使用濃度后與馬爾尼菲青霉分生孢子共孵育1h，再與培養2d的巨噬細胞共培養2h，臺盼藍淬滅5－FITC 15min，洗滌收集巨噬細胞，流式細胞儀測定吞噬率，實驗結果采用SPSS 13．0統計軟件進行分析。

2 結 果

2．1 竹鼠巨噬細胞形態觀察

2．1．1 普通顯微鏡觀察 將分離到的竹鼠巨噬細胞培養24h后鏡下觀察，可見肺泡巨噬細胞多貼壁生長，細胞呈圓形、橢圓形、三角形或不規則形，多有偽足。腹腔及脾臟來源巨噬細胞較肺泡巨噬細胞體積小，不完全貼壁，大多呈圓形、橢圓形，部分呈三角形，不規則形（圖1）。培養過程中三種來源的巨噬細胞未見明顯細胞有絲分裂相。培養4d后，細胞形態變異較大，貼壁細胞開始減少，有細胞碎片。

2．1．2 瑞氏－吉姆薩染色 細胞經瑞氏－吉姆薩染色后，光鏡觀察可見細胞界限清楚。肺泡巨噬細胞形態多樣，有鈍圓形突起胞漿較多，核大深染，為卵圓形、腎形、馬蹄形或不規則形，偏居于細胞的一側。腹腔及脾臟來源巨噬細胞較肺泡巨噬細胞體積小，大多呈圓形、橢圓形，部分呈三角形，不規則形，胞漿相對較少（圖2）。

2．1．3 透射電鏡觀察 電鏡下可見細胞形狀不規則，細胞表面有數量不等微皺褶、微絨毛；細胞核呈卵圓形或馬蹄形；細胞質豐富，內有大量溶酶體，線粒體數量較少，呈不規則圓球形，部分線粒體嵴略有腫脹，可見少量游離核糖體和內質網等細胞器，有些細胞內有大量泡狀小體，呈橢圓形或圓形，具有巨噬細胞形態結構特點（圖3）。

2．2 吞噬功能檢測

2．2．1 電鏡觀察巨噬細胞吞噬馬爾尼菲青霉分生孢子 不同來源巨噬細胞與馬爾尼菲青霉分生孢子共培養2h后，可見部分細胞吞噬有數量不等的真菌孢子，且吞噬馬爾尼菲青霉分生孢子的巨噬細胞表面突起較多，較粗大，吞噬空泡較多（圖3），具有巨噬細胞吞噬特性。巨噬細胞細胞器如線粒體、內質網、溶酶體等未見明顯數量及結構變化。被巨噬細胞吞噬的馬爾尼菲青霉分生孢子形態結構也未見明顯改變。

2．2．2 流式細胞技術檢測吞噬率 采用流式細胞儀測定肺泡、腹腔、脾臟巨噬細胞對馬爾尼菲青霉分生孢子的吞噬率分別為（75．09±6．92）%、（83．36±0．87）%、（78．84±3．73）%，流式分析結果見圖4，應用SPSS 13．0軟件，采用 Kruskal－Wallis檢驗，χ2＝6．96，P＝0．031（＜0．05），3種來源巨噬細胞對馬爾尼菲青霉分生孢子吞噬率有統計學差異。

3 討 論

馬爾尼菲青霉病常見于艾滋病患者等免疫力低下人群，患者感染此病現多認為是由肺吸入馬爾尼菲青霉分生孢子所致。竹鼠作為一類野生動物，多見于東南亞及我國廣東、廣西等地，與馬爾尼菲青霉病流行分布區域一致。據文獻報道，大多數野生竹鼠體內能分離出馬爾尼菲青霉且證實與感染人的菌群一致，人常見感染部位也與竹鼠體內分離部位大致一致，迄今為止尚未見有其他潛在動物分離出該菌的報道［3，5－6］。由于大多數竹鼠感染該菌后并無明顯臨床癥狀，且組織病理改變甚微，因此，竹鼠可能是馬爾尼菲青霉一個很重要的貯存庫，其本身并不致病［3］。但是竹鼠在馬爾尼菲青霉的傳播過程中的具體地位尚不明確。目前關于竹鼠與人馬爾尼菲青霉病相關性的研究多集中在野生竹鼠不同組織部位分離獲得馬爾尼菲青霉及竹鼠與馬爾尼菲青霉流行病學調查等方面。本研究選擇銀星竹鼠作為實驗動物，從能分離出馬爾尼菲青霉的常見感染部位（肺泡、腹腔和脾臟）分離獲得原代巨噬細胞，從巨噬細胞對馬爾尼菲青霉分生孢子吞噬作用出發，為進一步探討竹鼠與馬爾尼菲青霉及馬爾尼菲青霉病的相互關系奠定初步基礎。

由于竹鼠本身的生物學特性，原代巨噬細胞的分離獲得往往存在眾多不穩定因素，尤其是各種原因所致的肺出血、肺水腫等對所獲得肺泡巨噬細胞的數量及活性影響較大，而在脾臟巨噬細胞分離的過程中，貼壁純化的時間對獲得較純的巨噬細胞至關重要。在這3種分離方法中，腹腔巨噬細胞的分離較肺泡、脾臟巨噬細胞操作簡單、穩定性好、獲得細胞數量較多。透射電鏡下觀察3種來源的巨噬細胞對馬爾尼菲青霉分生孢子均具有吞噬作用，并采用流式細胞技術檢測三者均具有較高的吞噬率，統計學分析三者間吞噬率具有統計學差異，其中腹腔來源巨噬細胞對馬爾尼菲青霉分生孢子的吞噬率最高。電鏡下未發現吞噬后的馬爾尼菲青霉分生孢子形態結構的改變，也未發現巨噬細胞在吞噬真菌孢子后重要細胞器數量及結構的變化。竹鼠感染馬爾尼菲青霉后臨床癥狀不典型及組織病理變化輕微，可能與巨噬細胞對馬爾尼菲青霉免疫反應微弱或缺乏有關。因此竹鼠巨噬細胞在抗馬爾尼菲青霉感染過程中是否具有免疫殺傷作用甚至可能是一種保護作用尚需進一步研究。

綜上所述，本研究成功分離獲得銀星竹鼠肺泡、腹腔和脾臟來源巨噬細胞，這將為竹鼠生物學功能、細胞生理學的研究、病理模型的建立奠定基礎。來源于銀星竹鼠常見能分離出馬爾尼菲青霉的組織部位的巨噬細胞雖具有較強的吞噬馬爾尼菲青霉分生孢子能力，但電鏡下未見巨噬細胞細胞器及被吞噬的馬爾尼菲青霉分生孢子形態結構明顯改變，因此竹鼠巨噬細胞對馬爾尼菲青霉分生孢子是否具有免疫殺傷作用尚待更進一步研究。

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