氧化應激對骨髓間充質干細胞的影響

盧文藝，趙明峰

天津醫科大學一中心臨床學院 天津市第一中心醫院血液科，天津300192

骨髓間充質干細胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)來源于非造血基質組織的前體細胞，它具有干細胞特性和多向分化能力，在嚴格控制的培養環境中可以分化為軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞和肝細胞等，同時也具有一定的免疫調節能力［1］。由于MSCs具有這種多向分化能力以及免疫調節特性，其在干細胞治療和組織工程學上的應用潛力越來越受到人們的關注［2］。氧化應激作為機體常見的生理調節機制，在MSCs的各種病理狀態下起著至關重要的作用，許多研究都在致力于探索氧化應激對MSCs的作用機制。本文就氧化應激對MSCs影響的最新研究進展進行綜述。

骨髓MSCs的特點及功能

骨髓MSCs具有CD45-CD44+CD105+免疫表型，且與造血干細胞類似，它具有自我更新和多向分化能力，是非造血基質組織的前體細胞，可通過分泌多種細胞因子、生長因子和構建造血微環境來支持造血干細胞的擴增［3］。骨髓 MSCs可以直接分化為成骨細胞，成骨細胞是造血微環境最重要的組成部分，其表面的N-鈣黏蛋白和造血干細胞發生同型相互作用后介導造血干細胞定位到造血干細胞龕中［4］。骨髓MSCs還具有免疫調節特性，可通過影響T細胞、B細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞等多種免疫細胞來調節機體的免疫功能［5-6］。目前有關骨髓MSCs抑制T淋巴細胞的研究比較多，其作用方式可能主要通過以下3種途徑:(1)MSCs可能具有“否決”樣細胞 (veto cell)活性或間接通過否決細胞激活下游抑制信號來抑制T細胞;(2)通過激活調節性T細胞發揮作用;(3)MSCs誘導T細胞無反應性或通過細胞接觸、細胞因子及凋亡途徑等來抑制其功能［6］。

氧化應激及其病理生理機制

氧化應激是指體內活性氧 (reactive oxygen species，ROS)的生成增加和/或清除ROS的能力降低，導致ROS的生成和清除失衡，過量的ROS可引起生物大分子、細胞和機體的損傷。ROS由O2-、OH、HO2、RO2、RO等極性分子以及H2O2、O2等非極性分子構成，主要通過NADPH氧化酶途徑和線粒體電子傳遞鏈途徑生成［7］。為了阻止ROS的聚集，細胞內還存在多種抗氧化系統，如超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶以及一些保護細胞免受氧化應激損傷的氧化敏感型分子硫氧化還原蛋白、脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子-1(apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor 1，APE/REF-1)。ROS的大量聚集改變了細胞內的氧化還原狀態，通過氧化DNA、蛋白質、脂質等生物大分子，對細胞、組織和器官造成損害。過量的ROS通過增加線粒體外膜的滲透性，誘導線粒體滲透性轉移，使細胞色素C、凋亡誘導因子等促凋亡因子漏出，誘導細胞凋亡［8］。ROS還可通過增加端粒的損耗，使細胞周期停滯、加速細胞衰老。另外，ROS可觸發多種信號轉導途徑，如AKT、p38絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase，MAPK)、p53，最終導致細胞衰老或凋亡等不同反應。

氧化應激對骨髓MSCs的影響

作為影響細胞存活的重要因素之一，氧化應激可誘導骨髓MSCs的衰老及凋亡，阻礙其增殖并向成骨細胞分化的能力，該過程主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)、p53、p38 MAPK、APE/REF-1等信號轉導途徑。人們通過大量的研究還發現，通過對MSCs進行預處理可以減少氧化應激對骨髓MSCs的損傷，這對進一步探索氧化應激對骨髓MSCs的損傷機制意義重大。

氧化應激引起骨髓MSCs的衰老和凋亡及相關機制MSCs的衰老及凋亡會損傷組織和器官的修復能力，這是干細胞應用于治療中的一個重大問題。與胚胎干細胞不同，骨髓MSCs不具有無限自我更新的能力，它們復制的能力逐漸退化，最終會衰老死亡，這也被稱為復制性衰老［9］。而氧化應激導致的細胞內ROS大量聚集可使骨髓MSCs出現應激誘導的早熟性衰老 (stress-induced premature senescence，SIPS)，SIPS和復制性衰老都具有相似的形態學特征、β-半乳糖激酶活性及細胞周期停滯的特點［10］。細胞內過量的ROS還可通過p53途徑誘導細胞凋亡。通過抗氧化劑調控細胞內的ROS水平可以維持骨髓MSCs的特性，增加其存活，這更加證實了ROS對MSCs的作用。

眾多研究表明，ROS可通過多種途徑參與骨髓MSCs的衰老及凋亡，其中主要包括 AKT、p53、p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase，JNK)等信號分子。

PI3K/AKT是細胞在應激狀態下存活的重要信號途徑，它參與了體內許多生理機制的調控，如新陳代謝、細胞周期，以及細胞的遷移和生存。AKT信號途徑磷酸化后可以激活B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗凋亡蛋白，它還能使 Bad、caspase-9和FH轉錄因子等凋亡因子失活，增加細胞的抗凋亡能力［11］。在給予AKT抑制劑阻礙AKT信號傳導通路后，它在氧化應激條件下保護細胞生存的能力明顯下降，這更加肯定了AKT對骨髓MSCs的保護作用。AKT的磷酸化同時能通過增加p38β的活性來降低細胞內ROS水平，抑制凋亡分子JNK［2］。不僅如此，有報道稱AKT信號途徑的磷酸化還和MSCs的分化相關［12］。

p53/p21Cip1在細胞周期調節、凋亡、衰老、分化等多種生物過程中起重要作用。過度的氧化應激會使細胞內聚集大量的ROS，這些活性氧簇會通過p53作用其下游靶點p21Cip1來抑制CDK/cyclin復合體的活性并下調pRb/E2F軸，最終降低MSCs的自我更新及再生能力，促使其衰老［13-15］。p53/p21途徑還可通過和p16/pRb途徑相互作用共同誘導細胞出現SIPS［14］。相反，有研究表明p53能感受細胞內的ROS，具有抗凋亡活性［16］。p53轉錄因子還參與了骨髓MSCs的凋亡，它不僅可以上調Bax、Bak等促凋亡因子，還通過下調Bcl-2、Bcl-x等抗凋亡因子來影響 MSCs的存活［13］。

另外，還有研究證實:p38 MAPK途徑的激活參與調節骨髓MSCs細胞的早期凋亡，JNK信號途徑則調節骨髓MSCs細胞的晚期凋亡［17］。ROS通過線粒體途徑和內質網應激靶向p38 MAPK途徑，p38 MAPK通過調節Bax的轉移和細胞色素C的釋放誘導骨髓MSCs的凋亡。增加的ROS還會激活氧化敏感型JNK信號通路，JNK發生磷酸化后會從細胞質轉移到線粒體內，使線粒體發生去極化而降低線粒體的膜電位、釋放線粒體中的細胞色素c入胞漿。Bax發生寡聚化并轉移到線粒體膜上加速了細胞色素C的釋放，進一步激活caspase-3，形成依賴caspase的凋亡途徑，最終誘導骨髓MSCs的凋亡［17］。

氧化應激抑制骨髓MSCs的增殖和分化及相關機制在氧化應激條件下，ROS介導了有關細胞增殖的生長信號途徑，還有一些間接證據表明，給予細胞抗氧化劑治療后可以降低ROS對骨髓MSCs增殖及分化的影響［18］。在MSCs向成骨細胞分化過程中，抗氧化酶的合成會上調，繼而ROS的生成會減少，這提示較低濃度的ROS更有利于骨髓MSCs向成骨細胞分化。體外實驗已經證實外源性過氧化氫可以阻礙MSCs向成骨細胞分化，因此ROS的聚集可阻礙 MSCs的分化［19］。

雖然已經有報道指明ROS可影響MSCs的增殖及分化，但其作用途徑尚未明確，仍需要大量研究進一步探索。新近研究發現，APE/REF-1及細胞外信號調節蛋白激酶 (extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號分子涉及該過程。

APE/REF-1酶是修復氧化性損傷的限速酶，ROS對機體造成的損傷可以誘導該酶生成。APE/REF-1信號途徑可以阻礙細胞內ROS的聚集，進而調控MSCs的分化［20］。APE/REF-1通過抑制 NADPH氧化酶來降低細胞內的ROS，激活型的APE/REF-1能和一些氧化應激調控轉錄分子如缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factors，HIF-1)、p53、活化蛋白-1結合，這些轉錄分子會改變應激反應信號轉導通路相關基因的表達。同時，該信號途徑也可通過和p53的交互作用調控MSCs的衰老。氧化型APE/REF-1能促進p53與DNA結合的同時，p53也對APE/REF-1起著負性調節作用。在內皮細胞和成纖維細胞中，氧化應激造成的細胞內ROS水平的升高會誘導APE1/REF-1的表達。然而，Heo等［20］在體外建立了MSCs的氧化應激模型，他們發現在給予H2O2處理48 h后，MSCs內表達的APE1/REF-1在轉錄水平和蛋白水平都出現下降。這種現象可能是因為ROS過度的聚集破壞了細胞內的抗氧化能力，激活的p53使APE1/REF-1的表達下降，進一步加重了氧化應激誘導的MSCs的衰老。

ERK信號通路與MSCs的增殖和分化有關，它屬于MAPK家族。MAPK的激活可以誘導間充質向成骨細胞分化，抑制其向脂肪細胞分化。MAPK途徑可激活并磷酸化核結合因子α1(core binding factor α1，cbfα1)，cbfα1可誘導成骨細胞特異 Ocn基因的轉錄和骨髓細胞外基質的合成，該基因缺失的純合子小鼠成骨細胞功能會喪失［21］。持續的ERK2激活可促進MSCs向成骨細胞的分化，另外它還參與了骨橋蛋白的表達、基質的沉積和礦化。關于ERK1/2對MSCs增殖的作用眾說紛紜:有部分學者認為，ERK1/2途徑介導了肝細胞生長因子對MSCs有絲分裂的抑制，從而阻礙了細胞的增殖;相反，還有大量證據證明ERK1/2途徑能促進MSCs的增殖，用表皮生長因子處理的人骨髓MSCs表現出明顯的增殖活性，實驗證明這和ERK的表達呈正相關［22-23］。研究表明，抗氧化劑白藜蘆醇可通過ERK途徑提高骨髓MSCs的增殖能力并誘導MSCs向成骨細胞分化，且應用ERK特異性抑制劑PD98059后，抗氧化劑的作用明顯被抑制［18］。由此可見，ROS很有可能通過該途徑影響骨髓MSCs的增殖與分化。

有趣的是，衰老相關的信號途徑也同時介導著骨髓MSCs的分化，研究證明PI3K也是MSCs分化的關鍵點，隨后對大量衰老相關蛋白的檢測更加證實了這點［24］。這提示要將MSCs的多種生物學行為聯系起來才能認清其作用機制。

抗氧化應激預處理可增強骨髓MSCs的功能氧化應激對骨髓MSCs的作用嚴重影響其存活，增加其抗氧化應激能力成為提高MSCs移植效果的突破點。最近，越來越多的報道表明，用趨化因子、生長因子、藥物、缺氧等因素預處理可以明顯改善MSCs的存活能力，預處理的細胞能減少ROS對細胞活性、細胞膜以及氧代謝的損害，并增加HIF-1α、生存素、磷酸化的AKT以及Bcl-2基因和蛋白水平的表達［25-27］。

越來越多的研究證實對骨髓MSCs進行抗氧化劑及其他藥物預處理可增強MSCs的抗氧化應激能力［25-26］。有研究表明，用擴血管藥物二氮嗪預處理可通過核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號傳導通路在預處理晚期保護骨髓MSCs免受氧化應激損傷。眾所周知，ROS可以通過激活NF-κB途徑發揮氧化應激反應，而多項研究表明激活的NF-κB可能和細胞發生癌變有關，所以對該途徑的精確調控是細胞凋亡和癌變的關鍵［26］。另外，一些抗氧化劑還可以通過抑制JNK的磷酸化來降低氧化應激對骨髓 MSCs的損傷［2］。

基于對組織進行缺血預處理可以保護缺血組織的損傷，人們提出了對干細胞進行缺氧預處理可以改善氧化應激下干細胞的存活。長期的缺氧可以導致細胞內NADPH氧化酶途徑激活，增加了ROS的產生，而且還能通過減少過氧化氫酶的表達來減少ROS的降解，使細胞處于氧化應激狀態。然而，缺氧預處理可以減少缺氧誘導的氧化應激對細胞造成的損傷，它不僅能通過增加AKT、Bcl-2等“存活基因”的表達來增加骨髓MSCs的存活，而且可以增加SOD等抗氧化酶水平來降低細胞內的ROS水平。同時，缺氧預處理還能恢復因缺氧造成的細胞流動性的改變［27］。

需要指出的是，氧化應激通過這些不同信號通路作用于骨髓MSCs所產生的作用是一個多因素綜合的結果，信號之間會相互影響交織成一個復雜的信號傳遞網絡從而維持骨髓MSCs的正常功能，所以就會出現不同研究對同一信號通路相關激酶的激活和抑制都會對骨髓MSCs產生相同的作用。因此，需要對多種信號通路綜合分析才能更清楚地認識到氧化應激對骨髓MSCs作用的結果。

結 語

氧化應激可通過多種信號轉導途徑來影響骨髓MSCs的存活、衰老及增殖分化，各種干預措施可以通過改變ROS的代謝及作用于相關信號轉導途徑來調節骨髓MSCs的生物學行為。ROS對骨髓MSCs的作用也啟示可以通過ROS介導的信號途徑來調控白血病干細胞的分化、凋亡及衰老，這對治療惡性血液系統疾病具有深遠的意義。氧化應激對MSCs的影響不僅為干預造血性疾病找到了新的靶點，而且為MSCs的體外擴增及修復受損組織提供了有力保障，使MSCs能廣泛地應用于消化、循環、神經、免疫等多種系統疾病的治療中。

［1］Paniushin OV，Domaratskaia EI，Starostin VI.Mesenchymal stem cells:sources，phenotype，and differentiation potential［J］.Izv Akad Nauk Ser Biol，2006，33(1):6-25.

［2］Zhang W，Su X，Gao Y，et al.Berberine protects mesenchymal stem cells against hypoxia-induced apoptosis in vitro［J］.Biol Pharm Bull，2009，32(8):1335-1342.

［3］Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et al.Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs)and stromal cells［J］.J Cell Physiol，1998，176(1):57-66.

［4］Hosokawa K，Arai F，Yoshihara H.Function of oxidative stress in the regulation of hematopoietic stem cell-niche interaction ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，363(3):578-583.

［5］Aggarwal S，Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses ［J］.Blood，2005，105(4):1815-1822.

［6］Chen X，Armstrong MA，Li G.Mesenchymal stem cells in immuno-regulation ［J］.Immunol Cell Biol，2006，84(5):413-421.

［7］謝芳，趙明峰.活性氧物質對骨髓造血功能的影響［J］.中華血液學雜志，2011，32(2):133-136.

［8］Pervaiz S，Taneja R，Ghaffari S.Oxidative stress regulation of stem and progenitor cells［J］.Antioxid Redox Signaling，2009，11(11):2777-2789.

［9］Wagner W，Horn P，Castoldi M，et al.Replicative senescence of mesenchymal stem cells:a continuous and organized process［J］.PLoS One，2008，3(5):e2213.

［10］Frippiat C，Dewelle J，Remacle J，et al.Signal transduction in H2O2-induced senescence-like phenotype in human diploid fibroblasts［J］.Free Radic Biol Med，2002，33(10):1334-1346.

［11］Downward J.PI3-kinase，Akt and cell survival［J］.Semin Cell Dev Biol，2004，15(2):177-182.

［12］Plant MO，Wilder CL，Wells A，et al.Multipathway kinase signatures of multipotent stromal cells are predictive for osteogenic differentiation ［J］.Stem Cells，2009，27(11):2804-2814.

［13］Mimeault M，Batra SK.Recent insights into the molecular mechanisms involved in aging and the malignant transformation of adult stem/progenitor cells and their therapeutic implications［J］.Ageing Res Rev，2009，8(2):94-112.

［14］Yang DG，Liu L，Zheng XY.Cyclin-dependent kinase inhibitor p16(INK4a)and telomerase may co-modulate endothelial progenitor cells senescence ［J］.Ageing Res Rev，2008，7(2):137-146.

［15］Janzen V，Forkert R，Fleming HE，et al.Stem-cell ageing modifled by The cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a［J］.Nature，2006，443(7110):421-426.

［16］Matheu A，Maraver A，Klatt P，et al.Delayed ageing through damage protection by the Arf/p53 pathway ［J］.Nature，2007，448(7151):375-379.

［17］Wei H，Li Z，Hu S，et al.Apoptosis of mesenchymal stem cells induced by hydrogen peroxide concerns both endoplasmic reticulum stress and mitochondrial death pathway through regulation of caspases，p38 and JNK ［J］.J Cell Biochem，2010，111(4):967-978.

［18］Dai Z，Li Y，Quarles LD，et al.Resveratrol enhances proliferation and osteoblastic differentiation in human mesenchymal stem cells via ER-dependent ERK1/2 activation ［J］.Phytomedicine，2007，14(12):806-814.

［19］Chen CT，Shih YR，Kuo TK，et al.Coordinated changes of mitochondrial biogenesis and antioxidant enzymes during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2008，26(4):960-968.

［20］Heo JY，Jing K，Song KS，et al.Downregulation of APE1/Ref-1 is involved in the senescence of mesenchymal stem cells ［J］.Stem Cells，2009，27(6):1455-1462.

［21］Xiao G，Jiang D，Thomas P，et al.MAPK pathways activate and phosphorylate the osteoblast-specific transcripton factor，cbfa1 ［J］.J Biol Chem，2000，275(6):4453-4459.

［22］Forte G，Minieri M，Cossa P，et al.Hepatocyte growth factor effects on mesenchymal stem cells:proliferation，migration，and differentiation ［J］.Stem Cells，2006，24(1):23-33.

［23］Tamama K，Fan VH，Griffith LG，et al.Epidermal growth factor as a candidate for ex vivo expansion of bone marrowderived mesenchymal stem cells ［J］.Stem Cells，2006，24(3):686-695.

［24］Kratchmarova I，Blagoev B，Haack-Sorensen M，et al.Mechanism of divergent growth factor effects in mesenchymal stem cell differentiation ［J］.Science，2005，308(5727):1472-1477.

［25］Wisel S，Khan M，Kuppusamy ML，et al.Pharmacological preconditioning of mesenchymal stem cells with trimetazidine protects hypoxic cells against oxidative stress and enhances recovery of myocardial functionin infarcted heart through Bcl-2 expression ［J］.J Pharmacol Exp Ther，2009，329(2):543-550.

［26］Afzal MR，Haider HKh，Idris NM，et al.Preconditioning promotes survival and angiomyogenic potential of mesenchymal stem cells in the infarcted heart via NF-κB signaling［J］.Antioxid Redox Signal，2010，12(6):693-702.

［27］Peterson KM，Aly A，Lerman A，et al.Improved survival of mesenchymal stromal cell after hypoxia preconditioning:role of oxidative stress ［J］.Life Sci，2011，88(1-2):65-73.