哨兵動(dòng)物概述

李雨函，魏 強(qiáng)

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)中心，北京 100021）

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哨兵動(dòng)物是用于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中病原及病原感染的動(dòng)物。除特殊監(jiān)測(cè)需要之外，哨兵動(dòng)物一般來(lái)源于與被監(jiān)測(cè)動(dòng)物遺傳背景相同的無(wú)菌或 SPF級(jí)動(dòng)物。此外，根據(jù)監(jiān)測(cè)方式、目標(biāo)病原的不同需要選擇不同性別和年齡的哨兵動(dòng)物。哨兵動(dòng)物的設(shè)置方式和數(shù)量根據(jù)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)數(shù)量不同而有所區(qū)別，監(jiān)測(cè)過(guò)程中哨兵動(dòng)物與被監(jiān)測(cè)動(dòng)物之間的接觸方式主要分為間接接觸和直接接觸。使用哨兵動(dòng)物需要遵從兩個(gè)要點(diǎn)，一是要保證足夠檢測(cè)數(shù)量的同時(shí)使用最少量的哨兵動(dòng)物，二是在整個(gè)監(jiān)測(cè)過(guò)程中要使哨兵動(dòng)物最大限度的暴露于潛在的病原感染環(huán)境中。為監(jiān)測(cè)動(dòng)物群中病原微生物，必須對(duì)哨兵動(dòng)物定期進(jìn)行檢測(cè)。由于使用少量哨兵動(dòng)物能夠敏感、有效的反映整個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群的病原微生物狀態(tài)，因此，是一種非常高效的動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)方式。

1 哨兵動(dòng)物定義和適用性

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)中所指的哨兵動(dòng)物來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但使用目的不是用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而是為了監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群中病原微生物。也就是說(shuō)哨兵動(dòng)物是被特意放置在一定條件下或被飼養(yǎng)在特定位置，而這些位置最有可能是病原傳染的區(qū)域，使哨兵動(dòng)物感染疾病的機(jī)率增加。哨兵動(dòng)物作為檢測(cè)樣本，反映群體中病原傳播，當(dāng)沒(méi)有足夠動(dòng)物（如：僅有少量動(dòng)物且全部用于實(shí)驗(yàn)）用來(lái)做檢測(cè)時(shí)或同一個(gè)飼養(yǎng)單元中沒(méi)有合適的動(dòng)物用于做檢測(cè)（如：免疫缺陷動(dòng)物的血清學(xué)檢測(cè)會(huì)導(dǎo)致漏檢）的情況下，哨兵動(dòng)物是最適用的監(jiān)測(cè)方法［1，2］。

由于哨兵動(dòng)物的設(shè)置和管理沒(méi)有統(tǒng)一的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)或者法規(guī)，不同地區(qū)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)對(duì)該區(qū)域內(nèi)的哨兵動(dòng)物使用有一些建議和參考，具體的設(shè)置和管理要根據(jù)不同的目的而有所不同。因此，哨兵動(dòng)物的選用依實(shí)驗(yàn)而定。

2 哨兵動(dòng)物的選擇

2.1 基本原則

由于沒(méi)有統(tǒng)一施行的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，并且哨兵動(dòng)物的使用和設(shè)置需根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定，因此對(duì)哨兵動(dòng)物的選擇會(huì)不同，但應(yīng)遵循以下要素：①必須無(wú)菌或不攜帶有待監(jiān)測(cè)的特定病原以及抗體。②如果哨兵動(dòng)物和被監(jiān)測(cè)動(dòng)物來(lái)自不同的繁殖群，則需要選擇已知微生物狀態(tài)的動(dòng)物作為哨兵動(dòng)物。③盡可能與被監(jiān)測(cè)動(dòng)物群的品系相同，但根據(jù)監(jiān)測(cè)目的的不同，可選擇不同品系的哨兵動(dòng)物。④免疫反應(yīng)正常的適齡動(dòng)物。適齡動(dòng)物必須能反映出被監(jiān)測(cè)動(dòng)物的健康狀況［3］，一般選用4～8周齡的鼠［1，2］。

2.2 遺傳背景

因非近交系動(dòng)物容易繁殖、成活率高，因而相對(duì)便宜，通常情況下用非近交系動(dòng)物做哨兵動(dòng)物。雖然他們對(duì)大多數(shù)病原較敏感，但有的動(dòng)物發(fā)病時(shí)的臨床癥狀并不明顯。近交系動(dòng)物（如 DBA/2，BALB/c）相對(duì)雜交動(dòng)物較難繁殖且成本較高，不同品系之間對(duì)疾病的易感性和臨床表現(xiàn)有較大的區(qū)別。例如，鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）感染的A/J小鼠通常沒(méi)有非常明顯的臨床癥狀，但其他品系（如C57BL/6）鼠感染率和死亡率都很高。C57BL/6和其它有抵抗力的品系（如C57BL/10）感染鼠痘病毒（Ectromelia virus）后并不會(huì)有明顯癥狀［5］，然而敏感品系（如 A、DAB/2、BALB/c、C3H）感染鼠痘將導(dǎo)致鼠群內(nèi)高達(dá)80％～90％的感染率和死亡率［4，5］。另外，由于近交系動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)某些病原易感，所以適用于特殊情況下的病原監(jiān)測(cè)。

2.3 其他

因免疫缺陷動(dòng)物更容易被感染，所以在使用中應(yīng)特別注意對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境中微生物和其他污染物的控制。免疫缺陷動(dòng)物不能通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)它們是否被感染，但是對(duì)病原持續(xù)性感染有利于病原的分離。若需使用免疫缺陷動(dòng)物作為哨兵動(dòng)物，最好將免疫缺陷動(dòng)物（胸腺發(fā)育不完全的 Foxn1nu小鼠和Whnrnu大鼠，B 細(xì)胞和 T細(xì)胞缺乏的 Prkdcscid或Ragtm1Mom小鼠）和免疫系統(tǒng)正常的動(dòng)物放在相同飼養(yǎng)單元內(nèi)飼養(yǎng)（最好是有毛雜合體和裸鼠一起飼養(yǎng)）［1］。

此外，哨兵動(dòng)物進(jìn)場(chǎng)之前必須隔離觀察和檢測(cè)，這些都有助于減少經(jīng)哨兵動(dòng)物傳入的病原，這對(duì)免疫缺陷動(dòng)物尤其重要。為減少動(dòng)物間的打斗，尤其是雄性動(dòng)物為爭(zhēng)奪資源的打斗行為，接觸式哨兵動(dòng)物一般選用雌性動(dòng)物較容易與被監(jiān)測(cè)動(dòng)物群相容［2］。

3 哨兵動(dòng)物的應(yīng)用

3.1 使用方式

哨兵動(dòng)物與被監(jiān)測(cè)動(dòng)物的接觸方式分為間接接觸和直接接觸。

3.1.1 間接接觸：常用于監(jiān)測(cè)經(jīng)排泄物傳播的疾病，被監(jiān)測(cè)動(dòng)物數(shù)量較多，也用于監(jiān)測(cè)設(shè)備或運(yùn)輸材料是否帶有病原。間接接觸法中最常用的是舊墊料法，即每次換墊料時(shí)將被監(jiān)測(cè)籠盒內(nèi)取出約2盎司（約50 g）墊料放入哨兵動(dòng)物籠盒內(nèi)，或使用100％舊墊料［7］。為了保證有足量的墊料滿足動(dòng)物筑巢行為，也可加入一些新的墊料，但至少要保證50％的墊料是舊墊料。建議一個(gè)小鼠哨兵籠每次接受12～20個(gè)的被監(jiān)測(cè)籠的墊料，；大鼠和倉(cāng)鼠每次最多接受來(lái)自10個(gè)被監(jiān)測(cè)籠的墊料［6］。4～10周后，該批次哨兵動(dòng)物被送至檢測(cè)部門(mén)進(jìn)行檢測(cè)。如果飼養(yǎng)設(shè)施可以將收集的廢氣通入哨兵籠盒內(nèi)，也可利用廢氣法監(jiān)測(cè)經(jīng)呼吸道傳播的病原。因此，對(duì)哨兵動(dòng)物同時(shí)用舊墊料和廢氣可以有效增加 IVC系統(tǒng)中的微生物監(jiān)測(cè)效率。

3.1.2 直接接觸：即將哨兵動(dòng)物直接放入被監(jiān)測(cè)動(dòng)物群中，可監(jiān)測(cè)小范圍內(nèi)的經(jīng)氣溶膠或排泄物，分泌物傳播的疾病，這種方法可檢測(cè)到間接接觸法不能檢測(cè)到的病原，被監(jiān)測(cè)動(dòng)物數(shù)量較少［2］。雖然該法是病原更容易傳播的方法未得到證實(shí)，但該法可以有效的檢出一些經(jīng)氣溶膠和排泄、分泌物傳播的病原［3，8］，最適合用于小群體的健康監(jiān)測(cè)，也適用于一些經(jīng)由籠具或交叉感染引起的傳染病［2］。但在實(shí)際操作中，應(yīng)注意由于新個(gè)體的介入可能引起被監(jiān)測(cè)動(dòng)物與哨兵動(dòng)物打斗或者雄性動(dòng)物選擇哨兵動(dòng)物作為配偶等行為［9］。

3.2 監(jiān)測(cè)范圍和設(shè)置方法

3.2.1 入場(chǎng)前監(jiān)測(cè)：對(duì)新到的即將進(jìn)場(chǎng)的動(dòng)物必須進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。未進(jìn)場(chǎng)之前建議飼養(yǎng)在生物安全級(jí)別2級(jí)的負(fù)壓環(huán)境中。操作人員必須按照生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室要求穿戴工作服。動(dòng)物到達(dá)的72 h內(nèi)采集血、皮膚、糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)。在動(dòng)物群中放入接觸式哨兵動(dòng)物，18 d后取出哨兵動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果符合要求后動(dòng)物才能進(jìn)場(chǎng)飼養(yǎng)［2］。在之后的飼養(yǎng)階段中可以使用間接接觸式哨兵動(dòng)物。

3.2.2 入場(chǎng)后監(jiān)測(cè)：在使用開(kāi)架飼養(yǎng)和層流柜飼養(yǎng)小鼠時(shí)，應(yīng)在飼養(yǎng)架底層每側(cè)放置一個(gè)哨兵籠盒，用舊墊料法最多可以監(jiān)測(cè)34個(gè)籠位。飼養(yǎng)架上少于35個(gè)籠子的需要在飼養(yǎng)架進(jìn)口處放置一個(gè)哨兵籠。在飼養(yǎng)大鼠和地鼠架的底層每側(cè)放置一個(gè)哨兵籠，最多可以監(jiān)測(cè)24～30個(gè)籠子［10］。其它嚙齒動(dòng)物哨兵籠設(shè)置要根據(jù)需要而定。

IVC系統(tǒng)中根據(jù)飼養(yǎng)方式、條件和要求的不同，每個(gè)哨兵籠監(jiān)測(cè)的范圍也不同。整個(gè)系統(tǒng)中飼養(yǎng)的動(dòng)物都是同一品系、相同健康標(biāo)準(zhǔn)（如生產(chǎn)繁殖群）、且生產(chǎn)成本并不高的動(dòng)物群時(shí)，可采用隨機(jī)抽檢的方法。但因?yàn)槊恳粋€(gè)被抽檢到的籠盒只能代表其相近區(qū)域，要求均勻抽檢。

當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)的動(dòng)物比較珍貴但沒(méi)有足夠的剖檢資源；或同一系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)的動(dòng)物健康要求相同、但籠與籠之間品系不同，舊墊料法或者廢氣法監(jiān)測(cè)都很適用。若要求較高，可以同時(shí)用舊墊料加上廢氣法更加嚴(yán)格的控制動(dòng)物質(zhì)量［11］。在廢氣出口處順其流動(dòng)方向依次設(shè)置僅接受廢氣的哨兵動(dòng)物籠，僅接受舊墊料的哨兵動(dòng)物籠、及接受廢氣又接受舊墊料的哨兵動(dòng)物籠［11］。

每個(gè)籠內(nèi)飼養(yǎng)4只哨兵動(dòng)物，若實(shí)驗(yàn)沒(méi)有特殊要求，一批哨兵動(dòng)物使用不超過(guò)12周［10，11］。在第6周時(shí)取兩只哨兵動(dòng)物進(jìn)行剖檢，可以檢測(cè)前6周微生物狀態(tài)。同時(shí)在哨兵籠中加入兩只新的哨兵鼠以便檢測(cè)后6周微生物狀態(tài)。在12周結(jié)束后將哨兵籠中的4只哨兵鼠全部進(jìn)行剖檢［11］，后加入的兩只哨兵動(dòng)物可以反映出后六周的微生物污染狀況，另外2只可反映出1～12周的微生物狀態(tài)。

3.2.3 運(yùn)輸和設(shè)施監(jiān)測(cè)：為使運(yùn)輸過(guò)程中污染風(fēng)險(xiǎn)降低到最小，用哨兵動(dòng)物監(jiān)測(cè)整個(gè)運(yùn)輸過(guò)程是保證動(dòng)物質(zhì)量的一個(gè)有利方法［9］。在運(yùn)輸設(shè)備使用前后，將哨兵動(dòng)物飼養(yǎng)其中，4周后用血清學(xué)檢測(cè)哨兵動(dòng)物是否有感染。運(yùn)輸途中由于空氣對(duì)動(dòng)物質(zhì)量影響較大，哨兵動(dòng)物要和被監(jiān)測(cè)動(dòng)物飼養(yǎng)在同樣的籠子和環(huán)境中（如被監(jiān)測(cè)群體的籠具有過(guò)濾蓋，那么哨兵動(dòng)物的籠具也要有過(guò)濾蓋）［9］，運(yùn)抵目的地后隔離檢疫，沒(méi)有可疑狀況再轉(zhuǎn)入正常飼養(yǎng)環(huán)境［10］。

在用哨兵動(dòng)物對(duì)環(huán)境設(shè)施進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，根據(jù)檢測(cè)目的的不同來(lái)設(shè)置哨兵動(dòng)物。若被監(jiān)測(cè)設(shè)施有氣流和氣壓的設(shè)置，要求在氣流進(jìn)氣口處和排氣口處都放置哨兵動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)［6，9］。

3.3 檢測(cè)數(shù)量

哨兵動(dòng)物檢測(cè)數(shù)量根據(jù)被監(jiān)測(cè)動(dòng)物數(shù)量和待監(jiān)測(cè)微生物特性以及實(shí)驗(yàn)計(jì)劃而設(shè)定。取樣通常以飼養(yǎng)單元為基礎(chǔ)。一個(gè)飼養(yǎng)單元是指由同一個(gè)人（動(dòng)物飼養(yǎng)員或研究人員）管理的、衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)相同的特定動(dòng)物飼養(yǎng)區(qū)。為使檢測(cè)樣本在一定置信區(qū)間內(nèi)能代表整個(gè)群體的狀況，被檢動(dòng)物的數(shù)量要能適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)出動(dòng)物群中的感染率。FELASA推薦的公式，但僅適用于群體數(shù)大于100只，感染隨機(jī)分布于群體中，被檢樣本是隨機(jī)采樣，傳染不受性別年齡影響［3］。按照FELASA推薦的計(jì)算公式，期望檢出的感染率為 30％，置信度分別為 95％、99％、99.9％時(shí)，所需樣本量分別為10只、13只和20只動(dòng)物，在這些待檢動(dòng)物中至少有一只檢出為陽(yáng)性。

3.4 檢測(cè)頻率

檢測(cè)頻率是至少每季度檢測(cè)一次，也需要根據(jù)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境和研究需要增加檢測(cè)的頻率。發(fā)病和死亡的動(dòng)物必須剖檢，這是在常規(guī)檢測(cè)之外必須要做的，剖檢結(jié)果將指導(dǎo)是否要增加檢測(cè)頻率或者增加被檢動(dòng)物的數(shù)量。由于一些病原的宿主特異性還并不完全明了，有的飼養(yǎng)單元中不止飼養(yǎng)一種動(dòng)物，根據(jù)檢測(cè)日程，每種動(dòng)物要分開(kāi)檢測(cè)。同理，如果不同的品系對(duì)病原的血清學(xué)反應(yīng)不同也要分開(kāi)檢測(cè)。如果相同飼養(yǎng)單元內(nèi)飼養(yǎng)多個(gè)品系就需要至少每年對(duì)品系進(jìn)行一次檢測(cè)。檢測(cè)的樣本大小主要取決于被監(jiān)測(cè)動(dòng)物總數(shù)的多少、最終要檢出的感染率和檢測(cè)周期。如果病原感染的機(jī)率較高，檢測(cè)的頻率也要隨之增多。

4 總結(jié)

設(shè)置有效地監(jiān)測(cè)項(xiàng)目是保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要保障。設(shè)計(jì)一個(gè)有效地檢測(cè)項(xiàng)目要求將目標(biāo)置信度，被監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量、監(jiān)測(cè)時(shí)段，以及為達(dá)到質(zhì)量保障要求所必須的飼養(yǎng)環(huán)境都應(yīng)考慮周全。雖然質(zhì)量監(jiān)測(cè)項(xiàng)目需花費(fèi)經(jīng)費(fèi)和時(shí)間，但這樣的成本比發(fā)生疫情后導(dǎo)致?lián)p失或重建動(dòng)物種群的支出要少。根據(jù)監(jiān)測(cè)目標(biāo)來(lái)確定項(xiàng)目的花費(fèi)、監(jiān)測(cè)的有效時(shí)間和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義都應(yīng)體現(xiàn)在監(jiān)測(cè)項(xiàng)目的設(shè)計(jì)中，以確定操作和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的有效性。由于監(jiān)測(cè)項(xiàng)目的可行性是建立在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的，所以當(dāng)檢測(cè)項(xiàng)目設(shè)立的假設(shè)條件難以滿足時(shí)也會(huì)有監(jiān)測(cè)失敗。通過(guò)增加被檢動(dòng)物數(shù)量等適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充方法和限制措施來(lái)減少檢測(cè)項(xiàng)目失敗的概率也是有必要的。

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