SIVmac239病毒經不同途徑感染恒河猴急性期CD4+T細胞數量與其細胞表面CD95表達量的變化關系

高錫強，傅春燕，薛 婧，王 衛，陳 霆，魏 強

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京100021)

SIVmac239病毒經不同途徑感染恒河猴急性期CD4+T細胞數量與其細胞表面CD95表達量的變化關系

高錫強，傅春燕，薛 婧，王 衛，陳 霆，魏 強

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京100021)

目的 研究SIVmac239病毒分別通過直腸(rectal infection:IR)及靜脈(intravenous infection:IV)感染恒河猴，在感染急性期外周血CD4+T細胞數量與其細胞表面的死亡受體(CD95)表達量之間的變化關系。方法 將SIVmac239經直腸及靜脈途徑各感染14只恒河猴。監測病毒載量、CD4+T淋巴細胞數量及CD4+/CD8+比值的變化，從而明確感染。同時，在感染急性期內9個時間點采集靜脈血，并利用流式細胞術分析CD4+T細胞表面CD95的表達量。結果 靜脈組恒河猴CD95表達量于第2天開始升高，第7天達到最高，同時CD4+T淋巴細胞數降到最低。直腸組恒河猴也于感染后第2天開始升高，但第10天才達到最高值，CD4+T淋巴細胞數于第17天降到最低。同靜脈組相比，直腸組CD95表達量增高及CD4+T細胞數降低均較晚出現，且其CD4+T細胞數量降至最低晚于CD95表達量達到峰值一周后出現。結論 SIVmac239經直腸及靜脈感染恒河猴后，伴隨CD4+T細胞表面CD95表達的升高，CD4+T細胞數量逐漸下降。但不同感染途徑對CD4+T細胞表面CD95的表達量與CD4+T淋巴細胞數的變化不盡相同，這可能由于不同感染途徑造成CD95在感染急性期CD4+T細胞數量降低中發揮的作用不同。

SIV;CD4+T細胞;病毒載量;CD95;恒河猴

HIV/SIV感染途徑的不同會影響艾滋病的預后和疾病進程。CD4+T細胞數量的降低是衡量艾滋病疾病進程的重要指標，病毒感染后細胞表面死亡受體CD95的表達升高能夠介導細胞發生凋亡從而造成細胞數量的降低［1－3］。因此，利用非人靈長類動物模型了解不同感染途徑對急性期恒河猴體內CD4+T細胞數量及其細胞表面CD95表達量之間的變化關系，將為闡明經不同途徑感染艾滋病的發病機理以及疫苗開發等提供重要的參考［4］。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗選用28只健康的中國恒河猴，購自北京協爾鑫生物資源研究所。動物飼養及相關實驗在生物安全三級實驗室中進行。本研究已經通過相關倫理審查委員會批準，使用動物合格證號為ILAS－VL－2011－002，動物飼養以及樣品采集均遵照生物安全相關要求。實驗組隨機分為2組，靜脈感染組(IV)和直腸感染組(IR)，每組恒河猴雌雄各半。

1.2 攻毒方式

攻毒前一天晚上禁食，第2天肌內注射復方氯氨酮麻醉。靜脈組(IV)用105TCID50的SIVmac239經靜脈感染14只中國恒河猴。直腸組(IR)恒河猴為俯臥位以保證直腸黏膜充分暴露，緩慢將105TCID50的SIVmac239注入肛竇處，靜置30 min。

1.3 樣品采集和處理

靜脈組樣品采樣時間點分別為第 0、2、7、10、17、24、31、52 和 66 d，直腸組采樣時間分別 0、3、8、10、17、24、31、52 和 66 d。在每個時間點采集 5mL靜脈抗凝血。其中，50 μL用于檢測血常規，50 μL用于T淋巴細胞亞群分析。

1.4 CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群分析

使用三種單克隆抗體 CD3－PerCP、CD4－FITC 和CD8－PE標記新鮮的EDTA抗凝的外周血，室溫避光作用15 min后洗滌2次，細胞重懸于400 μL的PBS中，流式細胞儀分析并計數。

1.5 CD4+T淋巴細胞表面CD95表達量的檢測

使用CD95－APC標記新鮮的EDTA抗凝的外周血，室溫避光作用15 min后洗滌2次，細胞重懸于400 μL的PBS中，流式細胞儀檢測并分析 CD4+T細胞表面CD95的陽性百分比。

1.6 外周血病毒載量的檢測［5］

抗凝全血離心后取上清200 μL，利用 Trizol法提取血漿病毒RNA，熒光實時定量 RT－PCR法測定SIVmac239 RNA載量。

1.7 數據分析

流式數據使用FlowJo進行分析，作圖及統計分析使用Graphpad prism和SPSS軟件。

2 結果

2.1 CD4+T細胞表面CD95表達量的確定

將隨機抽取五只恒河猴的外周血混合，用四種單克隆抗體 CD3－PerCP、CD4－FITC、CD8－PE，CD95－APC標記外周血單個核細胞。如圖1所示，R1表示外周血單個核細胞中的淋巴細胞群，R2和R3分別表示CD4+T細胞(42.8%)和CD8+T細胞(18.2%)，M1則表示 CD4+T細胞表面 CD95的陽性百分比為46%。本研究用該方法檢測不同時間點外周血中CD4+T細胞表面CD95表達量的變化。

2.2 SIVmac239靜脈及直腸感染恒河猴外周血病毒載量結果

如圖2所示，SIVmac239經靜脈及直腸感染恒河猴后均出現典型的艾滋病發病的病毒載量變化，但靜脈組的血漿病毒載量明顯高于直腸組。隨著疾病進程的發展，進入到平臺期以后，靜脈組的病毒載量略高于直腸組。兩個感染組均于感染后第10天達到血漿病毒載量的高峰值，其中，靜脈組峰值達到6×106拷貝/mL，直腸組峰值達到2×106拷貝/mL，說明這兩種感染途徑都是HIV傳播的有效途徑。此外，靜脈組(第2天開始上升)病毒載量上升的時間明顯早于直腸組(第3天開始上升)，這可能是由于靜脈感染途徑更易于感染血液中的CD4+T淋巴細胞，而直腸組在黏膜部位的靶細胞相對較少，并存在抗SIV感染的局部黏膜免疫應答，因此在血液中檢測到病毒載量的時間相對滯后。

圖1 外周血CD4+T細胞表面CD95的表達量Fig.1 CD95 expression on the surface of peripheral blood CD4+T lymphocytes

圖2 靜脈及直腸感染恒河猴外周血病毒載量變化Fig.2 Changes of peripheral blood viral load from rhesus monkeys infected with SIVmac239 intrarectally or intravenously

2.3 SIVmac239靜脈及直腸感染恒河猴外周血CD4+T淋巴細胞數量的動態變化

靜脈及直腸感染 SIV后，恒河猴體內 CD4+T淋巴細胞絕對數都是先降低然后逐漸恢復至正常水平。同直腸組相比，靜脈組于靜脈感染后48 h CD4+T淋巴細胞數急劇升高達1 064個/μL，隨后迅速降低，直到第7天降至最低(441個/μL)。直腸組CD4+T淋巴細胞數于第17天降至最低為450個/μL，其降到最低點的時間比靜脈組推遲了10 d左右(圖3)。

2.4 SIVmac239靜脈及直腸感染恒河猴外周血中CD4+/CD8+T淋巴細胞比值的變化

如圖4所示，流式細胞術檢測了靜脈及直腸感染恒河猴外周血中CD4+/CD8+T淋巴細胞比例的變化。靜脈組在感染后CD4+/CD8+比值就急劇降低，第17天比例降至最低(小于1)。相比之下，直腸組CD4+/CD8+比值先升高(最高達3.37)，然后急劇下降，第24天降至最低(小于1)。

圖3 靜脈及直腸感染恒河猴外周血CD4+T淋巴細胞數量變化Fig.3 Changes of peripheral blood CD4+T lymphocytes in SIVmac239－infected rhesus monkeys intrarectally or intravenously

圖4 恒河猴外周血中CD4+/CD8+T淋巴細胞比值的變化Fig.4 Changes of peripheral blood CD4+/CD8+T lymphocyte ratio

2.5 SIVmac239經靜脈及直腸感染CD4+T淋巴細胞表面CD95表達量的變化

SIVmac239經靜脈及直腸感染恒河猴后病毒載量、CD4+T淋巴細胞數和CD4+/CD8+比值的變化均表明恒河猴已經成功感染了SIV。于是，我們用流式細胞儀檢測了CD4+T淋巴細胞表面CD95表達量的變化，即靜脈及直腸感染后CD95表達量均急劇升高然后恢復至正常水平。靜脈組于感染后第7天CD95表達百分比高達97%，直腸組則于感染后第10天比例達到69%。可見，CD95的表達量在感染的早期變化較大(主要發生于感染后前20 d內)，且靜脈組CD95的表達量明顯高于直腸組(圖5)。

圖5 CD4+T淋巴細胞表面CD95表達量的變化Fig.5 Changes of CD95 expression on the surface of CD4+T lymphocytes

2.6 靜脈及直腸感染對CD4+T細胞表面CD95表達量與其絕對數的影響

圖6為不同時間點CD4+T細胞表面CD95表達量與CD4+T細胞數進行了比較分析。兩種途徑感染后的30 d之內是發病的急性期，感染后第2天起CD4+T細胞表面CD95的表達量均有所增加，且靜脈組CD95表達百分比增加的幅度明顯高于直腸組。同直腸組相比，靜脈組CD95表達量于第七天達到高峰，同時CD4+T淋巴細胞數降到最低。直腸組則于第10天達到高峰，與靜脈組相比兩者峰值相差29.5。此外，直腸組CD95表達量增高及CD4+T細胞數降低均較晚出現，且其CD4+T細胞數量的最低值晚于CD95表達量達到峰值1周后出現。

圖6 CD4+T淋巴細胞數與其表面CD95表達量的變化Fig.6 The change of CD4+T lymphocytes and CD95 expression from peripheral blood of SIVmac239－infected rhesus monkeys

3 討論

SIV/恒河猴模型是艾滋病研究應用最為廣泛的非人靈長類動物模型。目前，SIV/恒河猴模型主要有印度源恒河猴和中國源恒河猴。鑒于SIV感染印度源恒河猴的疾病病程發展較快，與HIV感染的疾病進程不同，因此，中國源恒河猴更能較好的作為艾滋病的動物模型［6］。

死亡受體 CD95(AP0－1/Fas－)是腫瘤壞死因子(TNF)/神經生長因子(NGF)受體超家族成員，為I型跨膜糖蛋白，胞外段含有157個氨基酸，其中含有兩個功能域:一個是 N端的配體結合前聚集域(PLAD)，具有在結合配體前即促使Fas自身三聚體化作用;另一個是緊接的配體結合域(ligand binding domain，LBD)，具有結合 Fas配體的作用，從而誘導細胞發生凋亡［7－9］。HIV/SIV感染的一個顯著臨床特征是CD4+T淋巴細胞的數量降低。CD95在正常細胞表面表達量恒定，其表達量升高時可以介導細胞發生凋亡［10，11］。

我們的研究結果表明經靜脈及直腸感染SIV后，CD95的表達量在急性期早期有一短暫而急劇的升高過程，這可能是其介導急性期CD4+T淋巴細胞因凋亡而導致數量降低的原因之一，急性期后期可能是由病毒的結構蛋白等其他誘導因素所致。除此以外，靜脈組CD95的表達量達到高峰時CD4+T淋巴細胞數量降到最低，但直腸組 CD95的表達量達到高峰后的7 d CD4+T淋巴細胞數量才降到最低。這可能是由于靜脈感染途徑病毒直接攻擊外周血CD4+T淋巴細胞，外界病原刺激致使CD95表達增高直接導致了CD4+T細胞的大量死亡，而直腸組病毒攻擊粘膜靶細胞，發揮局部黏膜免疫應答，因此即使病原刺激CD95表達增加但由于淋巴循環等其他因素致使CD4+T細胞的死亡稍晚出現。關于HIV/SIV患者中CD95介導CD4+T細胞凋亡的詳細機制有待于進一步的深入研究。

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CD95 Expressed on the Surface of CD4+T Cells During the Acute Phase of SIVmac239-Infection in Rhesus Monkeys by Different Routes

GAO Xi－qiang，FU Chun－yan，XUE Jing，WANG Wei，CHEN Ting，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To study the expression of death receptor(CD95)on the surface of peripheral blood CD4+T cells and the CD4+T cell numbers during the acute phase in SIVmac239 virus－infected rhesus monkeys challenged by rectal(rectal infection:IR)and intravenous(intravenous infection:IV)routes，respectively.Methods Fourteen rhesus monkeys were challenged with SIVmac239 intrarectally or intravenously.Infection was determined by monitoring the viral load，CD4+T lymphocyte number and CD4+/CD8+ratio.Flow cytometry analysis was used to assess the CD95 expressionon the surface of CD4+T cells at nine time points during the acute－phase infection.Results In the intravenous infection group，CD95 expression on the CD4+T cells began to increase on the next day after infection，and reached the peak value on the 7th day，meanwhile the CD4+T lymphocyte number was declined to the lowest point.In the rectal infection group it also began to rise on the following day after infection and the CD95 expression reached the peak value at 10 days after infection，but the number of CD4+T cells was reduced to the lowest point until the 17th day.Compared with the intravenous infection，the peak value of CD95 expression and the lowest point of CD4+T cell number appeared later in the IR group，and the peak value of CD95 expression occurred a week earlier to the lowest point of CD4+T cells.Conclusions CD95 expression of the CD4+T cells is increased and the amount of CD4+T cells is decreased in SIVmac 239－infected rhesus monkeys challenged intrarectally or intravenously.Our results show that CD95 expressed on the surface of CD4+T cells vary in the SIVmac 239－infected rhesus monkeys.It may be due to the different effects of CD95 during the acute phase infection induced by different routes.

SIV;CD4+T lymphocyte;viral load;CD95;Rhesus monkeys

R33;R734

A

1671－7856(2012)10－0014－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.010.004

2012－09－25

“十二·五”國家科技重大專項(2012ZX10004－501)。

高錫強(1982－)，男，研究生，比較醫學專業。

魏強，教授，博士生導師，研究方向:醫學實驗動物病毒學。Email:weiqiang0430@sohu.com。