人載脂蛋白C3基因轉基因小鼠的建立及血脂變化分析

全雄志，高 翔，張 旭，葛文萍，關菲菲，董 偉，張連峰，2

(1.衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，2.國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，中國醫學科學院實驗動物研究所和北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

載脂蛋白C(apolipoprotein C，ApoC)是血漿中一組水溶性的低分子量蛋白質，包括載脂蛋白C I、C II、C III和新近發現的C IV四個亞類，它們主要存在于乳糜微粒(chylom icron，CM)、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)中。載脂蛋白C在脂蛋白代謝中發揮著重要的作用。載脂蛋白C III(ApoC III)是載脂蛋白 C族中含量最豐富的一類，通過抑制血管內皮細胞表面的脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)以及肝脂酶(hepatic lipase，HL)等酶和受體的活性來影響血漿富含甘油三酯脂蛋白(triglyceride-rich lipoprotein，TRL)的代謝［1-2］。現在的研究證明，APOC3基因主要在肝臟和小腸中表達，但是在其他器官如肌肉、心臟、腎臟、脾臟等組織中也有一定量的表達［3-4］。所以，本研究利用轉基因技術建立了系統性表達人載脂蛋白C3(APOC3)基因的轉基因小鼠，旨在為進一步研究該基因與高血脂以及高血脂相關的心血管病提供工具動物。

1 材料和方法

1.1 人APOC3表達載體的構建及轉基因

基因購買自Origene公司，用PCR的方法克隆該基因的開放閱讀框，并在兩端引入酶切位點Xho I (寶生物工程有限公司 中國)和 EcoR I(寶生物工程有限公司 中國)，插入pMD-18T simple vector(寶生物工程有限公司 中國)，測序結果無突變。以Xho I和EcoR I進行酶切回收該基因片段，插入系統性表達啟動子Ubc下游構建人APOC3轉基因載體。構建成功后，再用Pvu II(寶生物工程有限公司中國)將其線形化，獲得Ubc啟動的人APOC3基因轉基因片段。調整濃度至5ng/μL，用顯微注射法(TE2000-U顯微注射儀)將線性化的轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制備轉基因小鼠。C57BL/6J小鼠購自中國醫學科學院實驗動物研究所康藍公司【SCXK-(京)2009-0007】，用ICR小鼠作假孕受體，購自中國醫學科學院實驗動物研究所康藍公司【SCXK-(京)2009-0007】。實驗中涉及動物的操作程序已經得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為GC-09-2063。

1.2 PCR鑒定人 APOC3基因轉基因小鼠的基因型

轉基因小鼠在9～14日齡時用剪趾法標記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，利用特異引物通過 PCR法進行檢測。PCR反應條件：DNA模板10～100ng，上游引物為5'-TCCTTGTTGT TGCCCTCCT-3'，下游引物為5'-ACGGCTGAAGTTG GTCTGAC-3'(英濰捷基(上海)貿易有限公司，中國)。PCR反應體系20μL(試劑購自寶生物工程有限公司，中國)。反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重復變性到延伸29次，完成30個循環。目的基因APOC3片段為274bp。

1.3 Western blot檢測鑒定APOC3基因的表達

提取人APOC3轉基因小鼠與同齡野生型小鼠血液、肝臟、肌肉、小腸、心臟、腎臟、脾臟總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉移至 NC膜上(Millipore美國)，置于5%脫脂奶粉封閉液，用山羊抗人APOC3抗體檢測基因的表達水平(Abcam)。采用辣根過氧化物酶(H rp)-耦聯的兔抗羊抗體結合一抗(Pierce，USA)，用Hrp-耦聯的鼠抗GAPDH單克隆抗體做為內參(康成生物，中國)。

1.4 血生化分析檢測不同月齡轉基因小鼠與同齡野生型小鼠的血脂指標

分別選用3、5、7、9月齡的轉基因陽性小鼠6只(n=6)，和同齡野生型小鼠6只(n=6)，雌雄各半，眼眶靜脈取血，室溫靜置30min，4℃、5000r/min、離心15min，分離血清。用血生化分析儀(日立7020日本)分析小鼠血脂指標。實驗所得數據利用SPSS 11.5軟件進行組間差異的比較，采用的是獨立樣本的t檢驗(independent-sample t test)。

1.5 脂肪染色觀察5月齡轉基因小鼠與同齡野生型小鼠的肝臟脂肪水平

選用5月齡的轉基因陽性和同齡野生小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，打開腹腔取出肝臟，將肝臟組織固定在4%中性甲醛中48h，進行修塊、脫水、包埋、切片、油紅O染色和鏡下觀察(Nikon顯微鏡，日本和Leica MZ16F體視鏡，德國)。

2 結果

2.1 表達載體的構建

用PCR克隆的人APOC3基因，測序結果表明同已報道的人APOC3序列完全一致(Gene ID：345，NM-000040)。將該基因插入系統性表達啟動子Ubc下游，構建人APOC3基因轉基因載體(圖1)。

圖1 APOC3基因轉基因表達載體Fig.1 APOC3transgenic construct

2.2 APOC3轉基因小鼠基因型的鑒定

用顯微注射法將線性化的轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生后9～14d提取基因組DNA，用PCR擴增APOC3目的基因274bp的片段來檢測APOC3轉基因小鼠(圖2)，共得到6只首建鼠均可傳代。

圖2 PCR鑒定APOC3轉基因小鼠基因型注：P：陽性對照；N：陰性對照；W：空白對照；M：DNA相對分子質量標記；1、2、5、9、11、12是F0代陽性轉基因小鼠；3、4、6、7、8、10、13、14是F0代陰性小鼠。Fig.2 Genotyping of the APOC3transgenic m ice by PCRNote：P is positive control；N is negative control；W is blank control；M is DNA molecular weight marker；Lane 1，2，5，9，11，12are positive transgenic mice；Lane 3，4，6，7，8，10，13，14are F0negative mice.

2.3 APOC3基因的表達

首先用Western blot分析6個系1月齡的轉基因小鼠血液中 APOC3的表達情況，結果顯示APOC3在血液中均有表達(圖3A)，選取表達高的一個系保種繁殖，并進行下一步實驗。繼續用Western blot分析選出的高表達系的3、5、7、9月齡APOC3轉基因小鼠與同齡野生型小鼠血液中APOC3的表達情況，其中 5月齡表達量最高(圖3B)。因此，進一步分析5月齡轉基因小鼠與同齡野生型小鼠全身多種組織的總蛋白中APOC3的表達情況，結果顯示APOC3基因肝臟、小腸、肌肉、心臟、腎臟、脾臟中皆有高表達(圖3C)。

2.4 不同月齡轉基因小鼠與同齡野生型小鼠的血脂指標

3，5，7，9月齡的轉基因小鼠與同齡野生型小鼠的血脂指標分析顯示，3、5、7、9月齡轉基因小鼠甘油三酯(triglyceride，TG)分別比同齡野生小鼠高20.7%(P＜0.01)、212.5%(P＜0.01)、41.2%(P＜0.01)、28.6%(P＜0.01)(圖4)。

2.5 肝臟脂肪水平

用5月齡的轉基因陽性和同齡野生小鼠肝臟組織進行油紅O染色，鏡下觀察顯示，脂肪顆粒呈橘紅色，呈片狀分布于肝臟組織內，血管周圍居多，轉基因陽性小鼠與同齡野生小鼠相比，脂肪顆粒明顯增多(圖5)。

3 討論

近年來，心血管疾病的發病率呈明顯的上升趨勢，已成為老年人的主要死亡原因之一，同時，血脂代謝紊亂在心血管疾病發生發展中的重要作用已得到大家的公認。ApoC III作為機體內TRL分解代謝的主要調節因子之一，大宗的臨床試驗證實，作為冠狀動脈疾病發生的預警信號，ApoC III比傳統意義上的血漿TG水平更有價值［5-10］。

圖3 APOC3基因在轉基因小鼠血液、肝臟、小腸、肌肉、心臟、腎臟、脾臟中的表達注：WT：野生型小鼠；1、2、5、9、11、12：轉基因小鼠；內參：GAPDH。Fig.3 Expression of APOC3in the blood，liver，intestine，muscle，heart，kidney and spleen of the transgenic mice Note：WT：Wild type mice；1，2，5，9，11，12：Transgenic mice；The Western blot is normalized with GAPDH.

圖4 不同月齡小鼠血漿甘油三酯含量注：野生組與轉基因組相比較，*P＜0.01Fig.4 Triglyceride of the mice at different agesNote：W ild type compared with the transgenic mice，*P＜0.01

動物實驗及人體實驗均表明，ApoC III在體內富含甘油三酯脂蛋白(TRL)的分解代謝中具有重要的調節作用，它是脂蛋白脂酶(LPL)的抑制劑，同時還可以抑制肝臟對TRL及其殘粒的攝取。脂蛋白脂酶(LPL)能催化 CM及 VLDL中甘油三酯的代謝，在血管內皮表面發揮作用，是TRL分解代謝的關鍵酶。ApoC III是脂蛋白脂酶最強的抑制劑之一［11］。國外學者研究證實，加 ApoC III到 ApoC III缺乏癥患者血清中可以降低20% ～50%的脂蛋白脂酶活性［12］。ApoC III能抑制肝臟攝取 CM、VLDL以及其殘粒，使血液中TG含量增加，引起高甘油三酯血癥。W ind ler等［13］以灌流大鼠肝臟為模型的研究發現，將人或大鼠 ApoC III加入到含有乳糜微粒或VLDL的肝灌流液中，可顯著減少肝臟對CM及VLDL的攝取。大量的動物及人體研究均表明，ApoC III是通過影響肝細胞膜上脂蛋白受體的識別功能而影響肝臟對TRL及其殘粒的代謝的。Maeda等［14］在動物實驗研究中發現，在轉人ApoC III基因小鼠中，當血漿ApoC III水平增加40%，血漿TG即增加2倍。

本研究經過Western blot篩選，得到了高表達人APOC3基因的轉基因小鼠品系。通過對不同月齡轉基因小鼠與野生型小鼠血生化分析結果的比較，以及肝臟脂肪染色觀察，證明該轉基因品系具有高脂血癥的表型，可以作為研究脂蛋白代謝紊亂、高脂血癥、脂肪肝、動脈粥樣硬化等疾病的實驗動物模型［15］。

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圖5 肝臟脂肪染色A：野生型小鼠肝臟；B：轉基因小鼠肝臟；C：野生型小鼠肝臟；D：轉基因小鼠肝臟；注：箭頭所示為肝臟脂肪顆粒。Fig.5 Distribution of fat in the mouse livers.Fat stainingA：The liver of a wild type mouse；B：The liver of a transgenic mouse；C：The liver of a wild type mouse；D：The liver of a transgenic mouse；Note：Arrows show the fat particles.