妊娠晚期腹腔注射酸性磷酸緩沖液對兩個近交系小鼠繁育生理影響的對比分析

戴麗軍，黃月玲，周敏儀，安勝利，任 韻，勞淑貞，高蔚櫻，樸金松，譚小軍，侯 敏

(1.廣州醫學院實驗動物中心，廣州 510182；3.南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院生物統計學系，廣州 510515；

2.廣州醫學院附屬腫瘤醫院、腫瘤研究所，4.病理科，廣州 510095)

SPF級C57BL/6J(B6)和BALB/c(B/c)是較早培育出的實驗小鼠近交品系，被廣泛應用于生理學、遺傳學、免疫學和腫瘤學等領域的研究中，是目前國際上用量最大的實驗動物之一［1］。在廣州醫學院2011年開展的科研類小鼠動物實驗中，B6和B/c的使用量占95%以上，這其中又有50%是用于生殖或以生殖為基礎的實驗研究(內部統計資料)，由此可見，繁殖育種是實驗過程中經常會涉及到的問題，提高雌性受孕率、準確判斷孕齡、掌握動物生長規律是提高實驗效率和保證實驗效果的重要手段。

我們在實驗性小鼠肺腺癌的科研工作中不僅使用了SPF級B6和B/c小鼠，而且實施了限時交配、判斷受孕、定時妊娠、妊娠晚期腹腔注射等實驗方法(部分工作已發表［2］)，對這兩個品系的小鼠在交配方式與受孕率的關系以及陰栓陽性、陰性的受孕作了仔細的記錄；同時，還對母鼠在妊娠晚期接受腹腔注射緩沖液后的孕期、離乳的子鼠數量以及子鼠早期生長發育情況等方面進行了觀察，并就妊娠晚期腹腔注射緩沖液對兩個品系小鼠繁育生理的影響做了進一步的分析。本文總結了實驗對照組的有關數據，比較分析腹腔注射對兩個品系小鼠繁育生理影響的差異，為在實驗研究中合理使用這兩個品系的小鼠提供更多的背景資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境

4～6周齡的SPF級B6和B/c小鼠(雄性各20只，雌性各60只)購自廣東省醫學實驗動物中心【生產許可證：SCXK(粵)2008-0002】，在檢疫室生活1周后，進入廣州醫學院實驗動物中心SPF級實驗室【使用許可證：SYXK(粵)2010-0104】飼養并進行交配實驗。實驗室條件為：室內溫度為20℃ ～26℃，相對濕度為40% ～70%，明暗交替為12h∶12h。動物自由飲用無菌酸化水(pH 2.5～3.0)和食用60Co滅菌的全價營養飼料(廣東省醫學實驗動物中心提供)，飲水每周更換1～2次，墊料視每盒小鼠的數量每周更換1～2次，所用物品均通過高溫高壓滅菌(121℃，30m in)，飼養流程嚴格按照 SPF級實驗動物設施 SOP操作。有關實驗程序由廣州醫學院實驗動物倫理委員會審核批準，符合中國動物實驗的福利倫理準則；所有實驗人員經過實驗動物相關知識培訓，取得合格證。

1.2 儀器與試劑

JJ100電子天平(精確到0.01g，常熟雙杰測試儀器廠制造)，用于體重測定。

磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、檸檬酸(citric acid)分別購自廣州化學試劑廠及天津市大茂化學試劑廠，腹腔注射用緩沖液為0.2M Na2HPO4/0.1M citric acid(pH 6.0)，0.22mm濾器過濾除菌；組織標本由乙醇、多元醇、冰乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等多種成分組成的復合固定液(上海璽華科貿有限公司)固定。

1.3 動物實驗

B6和B/c小鼠鼠齡滿10周、雌雄體重分別達到19 g～20g和21g～22g開始交配。交配前48h將雄鼠單獨分到一個盒內，交配當天下午17點將雌鼠放入雄鼠盒內，次日上午8點將雄鼠移出交配的盒子，并檢查雌鼠陰栓的情況。交配的當天記為妊娠0d，交配后的10d～14d間根據雌鼠增大的腹部和∕或體重確定其是否受孕；雄鼠休息 3d～7 d后，以同樣的方式再次用于交配。交配的第1、3次，采取2：1(♀/♂)全同胞兄妹近親交配方法，其余的采取1：1的方法，交配的方式方法、交配的時間和地點在兩個品系均完全匹配。

表1 交配方式與受孕率的關系Tab.1 The correlation between mating method and pregnancy rate

妊娠雌鼠單獨飼養，在交配的第17天下午3～4點之間接受腹腔注射緩沖液，劑量為10m L/kg體重，記錄生產日期(即：孕期)；子鼠25日齡離乳，測量其體重，記錄雌雄子鼠數量(即：存活子鼠數量)，自離乳之日起到滿8周齡，每周稱子鼠體重1次。離乳之后的母鼠不再用于交配實驗，因此，所有子鼠均為母鼠第1胎產生。

1.4 短期動物實驗及病理觀察

交配的方法如上所述，母鼠在接受腹腔注射緩沖液后24h被處死，立即取出子宮，觀察胚胎的存活情況和數量，并將母鼠的肝、右腎、脾和肺臟以及每一只胚胎去頭尾后固定，進行常規病理石蠟標本的處理，4μm切片，HE染色，鏡下觀察。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 不同交配方式下B6和B/c小鼠受孕率的比較

我們首先觀察到不同交配方式下兩個品系小鼠的受孕率有所不同(表1)，總的情況是B6較B/c為高，特別是在2雌1雄的交配方式下，B6每次都有1只雄鼠同時使2只雌性受孕，而B/c一次都沒有；兩組受孕率的差異無統計學意義，這主要是由于數據的變異度較大、樣本量不夠所致檢驗效能較低而引起(power＜0.146)。此外，B/c每次的受孕率相對穩定(標準差較小)，而B6的受孕率變異較大，表明B6的交配和受孕可能容易受到種種外在和內在因素的干擾。

2.2 陰栓與受孕的關系

觀察結果顯示，陰栓陽性的受孕率在B6和B/c不同(表2)，分別為37.3%和63.6%，具有顯著差異(P=0.010)，由此可見，即使在僅15h的限時交配條件下，用陰栓來判斷小鼠是否發生交配和受孕不是很好的指標，特別是在不同的品系中應用，差別可能會較大。

表2 陰栓與受孕有關系Tab.2 The correlation between vaginal plug and pregnancy

2.3 腹腔注射對孕期及子鼠數量的影響

自注射緩沖液之日起，每天上午11點和下午4點觀察B6和B/c孕鼠的生產情況，并規定11點之前生產的記為整天，11點之后、4點之前生產的加0.5d，如此記錄孕期，同時還盡可能記錄產仔數量。我們觀察到，B6的孕期稍長于B/c的，具有統計學差異(表3，P=0.036)；離乳的較出生的子鼠數量為少，B/c較B6存活的子鼠量為多，差異之處在于B6所失去的主要為雄性子鼠，但品系間的差別均沒有統計學意義(表3)。

表3 腹腔注射對B6和B/c受孕鼠孕期及離乳子鼠數量的影響Tab.3 Impact of intraperitoneal injection on the duration of pregnancy of B6and B/c dams and number of weaned offsprings

表4 C57B6/6J和BALB/c第一胎E18.5天胚胎的數量及體重Tab.4 The number and body weight of E18.5d fetuses from primigravid of C57BL/6J and BALB/c

2.4 腹腔注射對孕鼠主要器官及胚胎的影響

由于離乳子鼠數量的減少，我們補充了短期動物實驗，以明確腹腔注射緩沖液對孕鼠和子鼠所產生的影響，小鼠來源和鼠齡以及交配的環境、方式完全相同，腹腔注射后24h(也就是孕期達到18.5d、母鼠生產前)處死母鼠，對母鼠腹腔和其主要器官及胚胎進行病理觀察。結果顯示，母鼠腹膜光滑，腹腔內無滲出，所觀察的器官和胚胎中沒有明顯的急性病變(結果未顯示)；每只受孕鼠的胚胎數3～11只不等，平均為7.8個(表4)；一窩胚胎的體重相近，數量少的體重可能會大一點，B6平均的胚胎體重較B/c的為大，差異具有顯著性(表4，P= 0.000)；此外，38只B/c胚胎中有一只為死胎，而31只B6胚胎均為活的。這些結果說明，腹腔注射對母鼠及胚胎的直接影響均比較小。

2.5 子鼠早期生長發育狀況的比較

從離乳到第8周的體重所體現的子鼠早期生長發育情況(圖1)表明，除了第5周之外，無論是雄性還是雌性，每一觀察點的體重B6的均顯著低于B/c的(P均＜0.05)，顯然，B/c子鼠的生長在8周時達到了平臺，而B6子鼠的體重卻還在緩慢地增長(圖1)，二者早期的生長趨勢確實不同(重復測量方差分析的交互效應顯示P=0.000)。

3 討論

用定時交配(timed-mating)的方法來產生定時妊娠(timed-pregnancy)小鼠是許多研究所必需的，如作者的實驗要在妊娠的第17天腹腔注射致癌劑就是一個例子，因此，產生受孕鼠成為提高實驗效率的前提條件，包括兩個方面：一是使更多的雌鼠受孕，二是能夠準確判斷雌鼠受孕。使雌鼠受孕的方法基本為1雄1雌或1雄2(多)雌的交配方式，從我們的結果來看，1雄1雌的方式較好，品系間存在的差異(表1)即使沒有統計學意義，由于每一只受孕鼠都能產生一定量的子鼠，因而客觀實際效果明顯；1雄2(多)雌并不能提高受孕率，原因恐怕有許多，其中一個重要的原因可能是雄鼠再次發情需要一定的時間，而定時交配在時間上要求嚴格，對于費時、費錢的動物實驗，選準交配方式可以節省很多。

圖1 C57BL/6J和BALB/c子鼠生長曲線注：利用“重復測量方差分析”的方法比較兩品系、同性別小鼠在各觀察點的體重及其增長趨勢，結果為：雌性：周主效應F=904.464，P=0.000，品系主效應F=11794.651，P=0.000，交互效應F=27.768，P=0.000；雄性：周主效應F=2016.379，P=0.000，品系主效應F=18211.617，P=0.000，交互效應F=11.248，P=0.000；單純效應：除了第5周之外，所有其他觀察點組間比較均有顯著性差異，P＜0.05。Fig.1 The growth curve of C57BL/6J and BALB/c offspringsNote：Repeated measurement analysis was employed to analyze the body weight at each observation time point and the trend of body weight gain with time.The results were as follows：Female：Week F=904.464，P=0.000，strain F=11794.651，P=0.000，interactive effect F=27.768，P=0.000；Male：Week F=2016.379，P=0.000，strain F=18211.617，P=0.000，interactive effectF=11.248，P=0.000；Simple effect：P＜0.05at all time points except Week 5.

判斷受孕的方法有：陰栓判斷法［3］、陰道涂片法［4］、體重檢測法［5，6］、腹部增大觀察法［7］及技術要求較高的血清檢測、監測法［5］和超聲檢測法［8］等。這些方法各有優缺點，陰道涂片法雖簡單，但需連續觀察數天才能確切判斷，有一定的工作量，并對母鼠的操作較多；陰栓判斷法因簡單易行而被廣泛采用，而我們的研究發現陰栓陽性的受孕率實際上并不高，品系間的差異也較大(表1)，效率有限；比較而言，體重檢測法和腹部增大觀察法判斷受孕的準確率較高，但對只有2、3只胚胎的妊娠可能會漏判，且需10～14d左右，對需要在妊娠早期進行的實驗不適用，而在此基礎上改良的體重增加百分率或交配后1周體重與交配時基礎體重的差別可能是判斷受孕最易、最省、最準、又能較為早期判斷受孕的方法［5，6］。無論選擇怎樣的方法，關鍵在于結合具體的實驗要求和符合花費-效果(cost-effect)的原則。

我們的結果顯示，妊娠晚期腹腔注射酸性緩沖液對母鼠和胚胎的直接影響都比較小，但是，實際離乳的子鼠數量卻在兩個品系都有減少，以B6減少更為明顯(從預期的7.8個到實際的4.7個，表3、4)，這一減少似乎與孕期沒有直接的聯系，因為孕期是由基因決定的［9］，而 B6的孕期又較 B/c的顯著延長(表3，P=0.036)，并且我們觀察到子鼠多是在出生后3d之內被母鼠食掉的。因此，我們認為，腹腔注射對母鼠繁育生理的影響可能是多方面的：操作和酸性緩沖液對腹膜的刺激所產生的疼痛對繼而發生的生產有負性作用，盡管這些疼痛可能不強，也比較短暫，不足以導致早產的發生，卻足以激惹母鼠，導致母鼠母性較差，發生食仔現象；還有，操作和疼痛可能客觀上對初期乳汁的產生有負性作用，從而導致乳汁量不夠，少數新生鼠發生死亡，然后被母鼠清除，所不同的是，B/c可能要比B6小鼠的耐受性好些，受到的影響小些。有關妊娠期間操作對母鼠及子鼠的影響文獻中有報道，慢性的、重復的操作可以與同時給予的藥物產生疊加作用，導致永久的損傷［10］，我們目前還不能很好解釋為什么B6品系失去更多的為雄性子鼠，樣本量不足可能是一個原因。

由體重監測的子鼠早期生長發育的狀況進一步闡明了腹腔注射和酸性緩沖液對母鼠繁育生理的影響，B6小鼠18.5d的胚胎平均體重要比 B/c的為大(表4)，離乳時的體重反而較 B/c的為小(圖1)，二者均具有統計學差異(P =0.000)，說明腹腔注射可能對 B6的哺乳過程影響較大，因為在其每窩新生鼠平均數量少的情況下，似乎這些新生鼠沒有茁壯成長；從整體上看，B6子鼠離乳后，短期內快速生長(thrive)，到第5周時達到了他們應有的體重(catch-up)，而5周之后的生長曲線可能才是真正反映B6品系的生長發育趨勢。我們比較了文獻報道的B6小鼠從離奶(21d)到10周的體重［11］，5～8周的數據與本實驗的十分接近，所存在的微小差異可能來自飼料，我們用的是60Co滅菌的全營養維持飼料，而文獻中用的是高壓滅菌飼料；另外，我們的數據標準差較大，而文獻中的甚小。

總之，實驗動物近交品系在長期嚴格近交繁育的過程中，形成了各自的遺傳特性，在繁殖生理和生長特性等方面，品系間具明顯差異［12-14］，對各品系繁殖方法、繁育特性和生長發育的跟蹤分析，可以為合理設計動物實驗提供科學數據和理論基礎［14］；受孕鼠在妊娠期間對各種微小操作都可能極為敏感，操作容易產生負性作用，影響繁育生理過程，對這些負性作用的充分認識，有助于課題的合理設計和實驗結果的可重復性。

［1］鄒移海，徐志偉，蘇鋼強.實驗動物學［M］.北京：科學出版社，2004：75-76.

［2］侯敏，戴麗軍，譚小軍，等.小鼠肺腺癌模型的建立及腫瘤病理分析［J］.中國實驗動物學報，2012，20(4)：75-79.

［3］高雅，林自力，張鴻波，等.自然發情與誘導發情小鼠子宮內膜中雌激素受體 α表達的比較［J］.中國實驗動物學報，2010，18(2)：168-171.

［4］宋波，武柏林，孫素菊，等.孕期及哺乳期鈣及維生素 D3干預對鉛暴露小鼠骨骼鉛動員影響的析因設計研究［J］.環境與健康雜志，2011，28(10)：877-880.

［5］Hau J，Skovgaard Jensen HJ.Diagnosis and monitoring of pregnancy in mice：correlations between maternal weight，fetal and placental mass and the maternal serum levels of progesterone，pregnancy-associated murine protein-2 and alpha-fetoprotein［J］.Lab Anim，1987，21(4)：306-310.

［6］Mader SL，Libal NL，Pritchett-Corning K，et al，Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered m ice［J］.Lab Anim(NY)，2009，38(9)：305-310.

［7］Silver LM.Mouse genetics：concepts and applications［M］.New York：Oxford University Press，1995，Vol.1，Chap.4，62-75.

［8］Brown SD，Zurakowski D，Rodriguez DP，et al.Ultrasound diagnosis of mouse pregnancy and gestational staging［J］.Comp Med，2006，56：262-271.

［9］Murray SA，Morgan J L，Kane C，et al.Mouse gestation length is genetically determined ［J］. PLoS One， 2010， 5(8)：e12418.

［10］Morales-Otal A，Olayo-Lortia J，Fernandez-Soto C，et al.The mild stress of chronic prenatal injections may have additive effects on drugs administered during pregnancy to alter brain sexual differentiation［J］.Neuro Endocrinol Lett，2010，31(5)：708-716.

［11］吳清洪，顧為望，張嘉寧，等.SPF級C57BL/6J小鼠生長發育和繁殖性能指標的測定［J］.中國比較醫學雜志，2006，16(10)：606-607，614.

［12］任連生，白喜花，閆磊，等.SX1近交系小鼠生長繁育主要指標的測定［J］.中國比較醫學雜志，2007，17(8)：470-472.

［13］戴麗軍，葉炳飛，黃月玲，等.Fm r1基因敲除對小鼠生理發育和繁殖性能的影響［J］.中國比較醫學雜志，2011，21(1)：64-66.

［14］Nagasawa H，Koshimizu U.Difference in reproductivity and offspring growth between litter numbers in four strains of mice［J］.Lab Anim，1989，23(4)：357-360.