豬鏈球菌2型毒力相關(guān)因子及保護(hù)性抗原研究進(jìn)展＊

何永聚，祝令偉，馮書章

豬鏈球菌是在世界范圍內(nèi)傳播的一個(gè)重要的人獸共患病原體，可引起豬的腦脊膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血病、關(guān)節(jié)炎等癥狀。在已分離的豬鏈球菌35個(gè)血清型中，豬鏈球菌2型（SS2）流行范圍最廣。1998年和2005年在中國(guó)江蘇省與四川省暴發(fā)了人感染SS2的疫情，分別引起14人和38人死亡［1］。目前已有報(bào)道超過(guò)700人感染SS2的病例，且主要集中在東南亞［2］。因此SS2嚴(yán)重危害著公共衛(wèi)生安全，已引起了科研人員及公眾的廣泛關(guān)注。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多SS2典型的毒力因子，其中莢膜多糖是最早被發(fā)現(xiàn)的主要的毒力因子［3］，之后其它一些毒力因子如溶血素、胞外蛋白因子、溶菌酶釋放蛋白、黏附素等也相繼被發(fā)現(xiàn)。然而研究發(fā)現(xiàn)，一些強(qiáng)毒菌株缺失掉這些毒力因子后，SS2仍有毒力，在一些無(wú)毒或弱毒菌株中也能檢測(cè)到這些毒力因子的存在，因此認(rèn)為SS2可能還存在著結(jié)構(gòu)與功能未知的毒力因子。以下對(duì)近幾年新發(fā)現(xiàn)的毒力相關(guān)因子和保護(hù)性抗原進(jìn)行論述。

1 調(diào)節(jié)因子

調(diào)節(jié)因子是在細(xì)菌基因表達(dá)調(diào)控中，在各種刺激信號(hào)的影響下通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)能直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在各順式作用元件的序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的因子，分正調(diào)控和負(fù)調(diào)控。這些因子雖不直接表達(dá)毒力蛋白，但大多能調(diào)節(jié)細(xì)菌在體內(nèi)的生存、對(duì)環(huán)境的耐受以及毒力因子的表達(dá)，是細(xì)菌重要的毒力相關(guān)因子，也是疫苗研究和新型抗菌藥物研究的重要靶點(diǎn)。

1．1 調(diào)節(jié)因子luxS luxS因子被報(bào)道在調(diào)節(jié)細(xì)菌各種活動(dòng)和種間傳播方面發(fā)揮顯著作用。在Wang Y等［4］的研究中，他們構(gòu)建了SS2基因缺失菌株△luxS，與野生株相比，突變株溶血活力明顯降低，對(duì)HEp－2細(xì)胞的黏附也降低了51%。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR顯示，已知的毒力因子如gdh、cps、mrp、gapdh、sly、fbps和ef 等在體內(nèi)的表達(dá)分別降低0．66、0．61、0．45、0．48、0．29、0．57 和0．38。在感染斑馬魚動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中，△luxS的半數(shù)致死劑量顯著升高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，luxS的缺失，使細(xì)菌的溶血活力、對(duì)細(xì)胞的粘附力及一些重要毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化。luxS因子因能干擾細(xì)菌的信號(hào)傳輸，對(duì)細(xì)菌毒力因子的表達(dá)有重要作用。

1．2 二元信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)CiaRH 二元信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Two－component regulatory systems，TCS）是致病菌中普遍存在的一種跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在調(diào)節(jié)毒力基因的表達(dá)中有重要作用。Li J等［5］構(gòu)建了TCSCiaRH基因敲除突變株，并研究突變株與野生株比較在體內(nèi)與體外毒力變化情況，突變株對(duì)Hep－2和PIEC上皮細(xì)胞的粘附力顯著減弱，CiaRH缺失使巨噬細(xì)胞對(duì)SS2的吞噬力增加，也提高了SS2在體內(nèi)血液中的清除率，CD1小鼠與豬的體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)也表明細(xì)菌致病力減弱。這些結(jié)果表明，CiaRH對(duì)豬鏈球菌2型的毒力也是必需的。

1．3 正向調(diào)節(jié)因子AdcR和Fur 鋅和鐵是細(xì)菌中一些蛋白的重要組分，在鏈球菌中AdcR和Fur控制著鋅和鐵的運(yùn)輸。在Aranda J等［6］的研究中，利用鼠模型測(cè)定SS2△AdcR和△Fur缺失株的毒力變化。結(jié)果顯示，△AdcR和△Fur缺失株與野生型親本株比較，毒力顯著減弱，并且所有缺失菌株對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)更加敏感。他們的數(shù)據(jù)證明AdcR和Fur基因在SS2氧化應(yīng)激反應(yīng)與SS2的全毒力中發(fā)揮著重要作用。

1．4 觸發(fā)因子（Trigger factor） Wu T 等［7］在研究中，闡明了觸發(fā)因子與細(xì)菌耐受應(yīng)激與毒力的關(guān)系，并構(gòu)建了SS2的SC21菌株tig全基因缺失菌株（△tig）和恢復(fù)互補(bǔ)菌株（C△tig），實(shí)驗(yàn)證明，缺失菌株對(duì)HEp－2細(xì)胞的粘附力顯著減弱、溶血能力下降，并對(duì)熱、氧化、酸等應(yīng)激耐受力下降，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR顯示tig基因?qū)σ阎腟S2的主要毒力因子，如cps、sly、mrp 等有顯著影響，同時(shí)△tig 的LD50也顯著降低。這些都指明觸發(fā)因子在SS2感染的發(fā)病機(jī)制和應(yīng)激耐受方面發(fā)揮重要作用。

1．5 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Rgg 王忠勝等［8］構(gòu)建了SS2強(qiáng)毒株05ZYH33調(diào)控因子Rgg的突變株，用基因芯片的方法分析野生株與缺失株的基因表達(dá)差異，并在突變株中發(fā)現(xiàn)了45個(gè)基因表達(dá)變化較大的基因，其中19個(gè)表達(dá)上調(diào)，26個(gè)表達(dá)下調(diào)。這些基因在細(xì)菌毒力、免疫抗原、DNA合成和修復(fù)、基礎(chǔ)代謝和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等方面起著重要作用，說(shuō)明Rgg是一個(gè)全局調(diào)控因子。

2 表面蛋白

細(xì)菌的表面元件，尤其是表面蛋白，由于和外界環(huán)境直接接觸，與病原菌的生存能力和致病性等密切相關(guān)。表面蛋白大多在細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附、血液的侵襲、凝血過(guò)程、免疫逃避以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)跨膜遞送等多方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，是多種病原菌感染宿主的必要環(huán)節(jié)［9］。SS2等革蘭氏陽(yáng)性菌表面蛋白要錨定在細(xì)菌細(xì)胞壁上，需要分選酶的切割并在分選酶的催化下與肽聚糖共價(jià)鍵結(jié)合。表面蛋白一般是重要的毒力因子或具有良好的免疫原性的保護(hù)性蛋白。2．1 分選酶Srt（Sortase） 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌表面蛋白和菌毛要錨定在細(xì)胞壁上需要分選酶（sortase，Srt）的催化參與。在SS2基因組中已知有6個(gè)與 Srt同源性的蛋白 （srtA、srtB、srtC、srtD、srtE、srtF），其中srtB、srtC、srtD 是一個(gè)簇。srtA是管家分選酶，負(fù)責(zé)所有含“LPXTG”基序的表面蛋白的催化和錨定。陳紅娜等［10］利用基因重組原理構(gòu)建了srtBCD缺失的突變株，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示srtBCD缺失后細(xì)菌的生長(zhǎng)速率減慢，與Hep－2上皮細(xì)胞的粘附率明顯降低，小鼠毒力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明突變株毒力無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)證明SS2的srtBCD基因與細(xì)菌的黏附能力有重要關(guān)系。陳紅娜等［11］還構(gòu)建了05ZYH33srtF同源突變體，突變菌株與野生菌株在菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率及對(duì)小鼠的致病力上均無(wú)顯著差異，但在小鼠競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，突變株在心臟的定殖及感染能力上顯著減弱。

2．2 菌毛亞單位（pilus subunit） 細(xì)菌的菌毛是細(xì)菌比較關(guān)鍵的毒力因子，其菌毛亞單位也看作極好的疫苗候選者，但是菌毛成分在SS2中的功能性作用和免疫保護(hù)潛力還未被研究。Garibaldi M等［12］使用蛋白組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)SS2表面蛋白，經(jīng)生物信息學(xué)分析、免疫印跡及免疫熒光檢測(cè)顯示是細(xì)菌的菌毛亞單位輔基，用小鼠模型做重組菌毛亞單位蛋白的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)小鼠SS2的感染有顯著的保護(hù)作用。秦躍紅等［13］構(gòu)建了SS2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33菌毛骨架蛋白編碼基因SSU2101敲除突變株，生物學(xué)特性和小鼠致病性試驗(yàn)顯示：雖然突變株的菌落形態(tài)、溶血活性以及染色特性方面與野生株之間均無(wú)明顯差異，但突變株的毒力比野生株顯著減弱。研究結(jié)果也提示菌毛在SS2感染致病過(guò)程中起重要作用。

2．3 保護(hù)性抗原HP0197 HP0197是一種新的已被確定的具有免疫原性的蛋白，在C端具有典型分選信號(hào)“LPXTG”，與已知的蛋白沒(méi)有任何同源性。Zhang A［14］等發(fā)現(xiàn)HP0197是一種新的表面保護(hù)性抗原，并對(duì)其保護(hù)性進(jìn)行了鑒定，在豬和小鼠模型內(nèi)研究了它的保護(hù)效力，并做了體外細(xì)胞試驗(yàn)和被動(dòng)免疫試驗(yàn)。證明HP0197具有很好的保護(hù)效力，這個(gè)蛋白也被認(rèn)為很可能成為新型疫苗的候選者。

2．4 保護(hù)性抗原 HP0272 Chen B等［15］發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的具有免疫原性的表面蛋白HP0272，用純化的HP0272免疫小鼠模型，能誘發(fā)顯著的體液免疫反應(yīng)，有很高的抗體滴度，對(duì)致死劑量的SS2感染具有完全的保護(hù)作用。實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)HP0272在幾乎所有的SS2菌株和半數(shù)其他型的參照菌株中存在，可以作為新型疫苗的候選者。

2．5 6－磷酸葡萄糖脫氫酶（6－phosphogluconate－dehyrogenase） 6－磷酸葡萄糖脫氫酶是與戊糖磷酸循環(huán)有關(guān)的酶，它催化6－磷酸葡萄糖氧化脫羧成5－磷酸核糖，同時(shí)釋放NADP，NADP認(rèn)為是NADPH的主要來(lái)源。Tan C［16］等對(duì)6－磷酸葡萄糖脫氫酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并證明6－磷酸葡萄糖脫氫酶是一種細(xì)胞壁表面蛋白，在小鼠模型中進(jìn)行試驗(yàn)，證明6－磷酸葡萄糖脫氫酶具有粘附素的作用，在hep－2及hela競(jìng)爭(zhēng)抑制性細(xì)胞試驗(yàn)中，6－磷酸葡萄糖脫氫酶競(jìng)爭(zhēng)性干擾SS2對(duì)這兩種細(xì)胞的粘附，干擾率分別為72%和66%。在動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中，對(duì)CD－1小鼠內(nèi)的保護(hù)效率達(dá)80%，是一種較好的保護(hù)性細(xì)胞表面抗原。

2．6 類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶SspA（subtilisinlike serine protease） Bonifait L等［17］證實(shí) SS2中的SspA與在其它致病性鏈球菌中的功能一樣，在SS2的感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Hu Q等［18］研究發(fā)現(xiàn)在SS2發(fā)病機(jī)制中SspA位于細(xì)菌表面，分別進(jìn)行體內(nèi)與體外表達(dá)發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體外表達(dá)，SspA蛋白約170kDa，具有生化活性，與其他微生物產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶相似。它具有很高的蛋白酶水解活性，同時(shí)能夠水解纖維蛋白原Aa鏈，因此可以抑制有凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白的生成。SspA在SS2感染機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，敲除這個(gè)基因的突變株與野生菌株相比毒力明顯減弱，在感染動(dòng)物體內(nèi)能夠促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，證明SspA與SS2毒力有關(guān)。

2．7 lgA1蛋白酶 致病菌的lgA1蛋白酶有助于細(xì)菌侵入機(jī)體的黏膜免疫系統(tǒng)。Zhang A等［19］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)iga基因缺失時(shí)，SS2的侵襲力明顯減弱。因此推斷，在侵入宿主的黏膜免疫系統(tǒng)時(shí)，分泌性的lgA1蛋白酶發(fā)揮著重要作用。另外，感染實(shí)驗(yàn)表明，敲除iga基因的菌株導(dǎo)致該致病菌的致死率下降。實(shí)驗(yàn)研究也表明lgA1蛋白酶可能是豬鏈球菌的毒力因子之一，在SS2的致病機(jī)制中起一定作用。

2．8 HtpS（histidine triad protein of Streptococcus suis）蛋白 三聯(lián)組氨酸蛋白屬于一個(gè)與豬鏈球菌表面相關(guān)的蛋白家族，該家族包含來(lái)自肺炎鏈球菌和化膿性鏈球菌的PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、HtpA 5個(gè)成員，它們也被證實(shí)可作為宿主感染的保護(hù)性抗原。Shao Z等［20］研究發(fā)現(xiàn)在 SS2的05ZYH33菌株中有一段與HtpA、PhtD高度同源的基因序列，并命名為HtpS。他們發(fā)現(xiàn)HtpS在SS2高度保守并在豬鏈球菌35個(gè)血清型中廣泛存在（29／35）。在SS2感染中表達(dá)的HtpS蛋白經(jīng)免疫印跡和流式細(xì)胞儀驗(yàn)證屬于細(xì)胞表面相關(guān)蛋白。抗HtpS蛋白血清能增加人體內(nèi)補(bǔ)體3的沉積并能降低SS2在血液中的溶血效應(yīng)。經(jīng)重組蛋白HtpS免疫后的小鼠能顯著增加它們?cè)赟S2感染后的存活率。

3 其它毒力相關(guān)因子

3．1 Trag（transfer gene G）基因 Trag基因是利用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù) IVI－AT （in vivo－induced antigen technology）通量篩選鑒定的豬鏈球菌2型的致病相關(guān)因子，Trag參與細(xì)菌的分泌途徑，是IV型分泌系統(tǒng)（type IV secretion system，TFSS）的組成成分，Trag基因在細(xì)菌感染過(guò)程中可能參與毒力因子的轉(zhuǎn)移、毒力蛋白的分泌，使宿主菌產(chǎn)生相應(yīng)的酶或毒素，導(dǎo)致毒力增強(qiáng)。祝昊丹［21］等檢測(cè)1998年江蘇及2005年四川流行株和其它臨床分離株中的Trag基因分布結(jié)果顯示，SS2、SS7中幾乎都有Trag基因的存在，SS9中大部分含有Trag，但是非毒力菌株SS1、SS1／2和蘭氏C群豬源鏈球菌中沒(méi)有Trag基因，這表明Trag基因可能與豬鏈球菌的毒力有關(guān)。

3．2 lin0523基因 李鵬等［22］利用溫敏穿梭自殺質(zhì)粒pSET4s，定點(diǎn)敲除SS2野生型強(qiáng)毒株ZY458的lin0523基因，構(gòu)建基因缺失突變菌株458Δlin，利用家兔感染模型對(duì)ZY458及其突變菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究。接種ZY458感染組家兔5／5死亡，458Δlin（plin）感染組家兔 4／5 死亡。而458Δlin感染組家兔生長(zhǎng)正常，未出現(xiàn)任何明顯臨床癥狀，證實(shí)lin0523基因與豬鏈球菌2型的毒力密切相關(guān)。

3．3 SSGI4基因島 祝令偉等［23］通過(guò)比較豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株與弱毒株和無(wú)毒株的基因組差異，發(fā)現(xiàn)一個(gè)只存在于強(qiáng)毒株，而在弱毒或無(wú)毒菌株中沒(méi)有的基因島，并命名為SSGI4。該基因島全長(zhǎng)11 269bp，包含11個(gè)編碼基因，部分基因推測(cè)為可能的膜表面蛋白基因或氨基酸結(jié)合蛋白基因。新發(fā)現(xiàn)的基因島SSGI4具有致病性基因島的各項(xiàng)典型特征，可能與豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株的致病性有關(guān)。

3．4 AI1（angiogenin inhibitor 1） 透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HAase）是能使透明質(zhì)酸產(chǎn)生低分子化作用酶的總稱，它在SS2感染過(guò)程中能夠降低體內(nèi)透明質(zhì)酸的活性，從而提高SS2在組織中液體滲透能力［24］。Tao Wu等［25］發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與SS2透明質(zhì)酸酶有關(guān)的新型血管生成素抑制因子AI1，血管生成素抑制因子是1種核糖核酸酶。應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)顯示AI1與酵母中的透明質(zhì)酸酶有關(guān)系，免疫共沉淀分析也證明AI1與透明質(zhì)酸酶有關(guān)系。并且在正常細(xì)胞和SS2感染的細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了所篩選的CDNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，且這些過(guò)程主要集中于293T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。這些結(jié)果表明AI1可能通過(guò)干擾SS2中透明質(zhì)酸酶影響SS2感染的發(fā)病機(jī)制。

3．5 異檸檬酸脫氫酶IDH（isocitrate dehydrogenase） 異檸檬酸脫氫酶是檸檬酸循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，這個(gè)酶可以催化檸檬酸化合物經(jīng)氧化脫羧作用生成α－酮戊二酸和NAD（P）H，在細(xì)菌的生存中不可缺少。Wang P等［26］過(guò)表達(dá)并研究了了SS2強(qiáng)毒株05ZYH33中的IDH，IDH大小約為74kDa，并且發(fā)現(xiàn)在SS2中，陽(yáng)性Mg2＋是對(duì)IDH影響最大的二價(jià)離子。IDH優(yōu)化最合適的pH分別是 Mn2＋7．0、Mg2＋8．5，溫度分別是 Mn2＋30℃、Mg2＋50℃活力最高。在SS2中IDH對(duì)NAD＋是一個(gè)重要的輔酶，Wang P等研究認(rèn)為IDH是SS2生存中重要的代謝酶，并期望IDH作為SS2感染檢測(cè)和血清學(xué)診斷的重要因子。

綜上所述，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多SS2的毒力因子，但SS2如何在動(dòng)物體內(nèi)傳播和感染，其主要的毒力因子是如何發(fā)揮作用的仍然所知有限。對(duì)已驗(yàn)證的、具有免疫保護(hù)作用的SS2強(qiáng)毒株主要毒力因子莢膜多糖（cps）的爭(zhēng)論也很多，因?yàn)楹芏酂o(wú)毒菌株也是有莢膜的。除cps外，很多可能的主要毒力因子也不是僅存在于豬鏈球菌強(qiáng)毒株中的，在弱毒或無(wú)毒菌株中它們都可以被發(fā)現(xiàn)。一些強(qiáng)毒菌株的毒力因子被敲除后，在多數(shù)情況下，它們的毒力會(huì)喪失或下降，這可能是因?yàn)镾S2的致病機(jī)理是多因子共同協(xié)作的結(jié)果，毒力因子之間的關(guān)系可能是互補(bǔ)的，1個(gè)因子的缺失導(dǎo)致整個(gè)菌株毒力的喪失或下降。所以對(duì)SS2的致病機(jī)理及毒力因子等方面的研究意義重大，還需廣大科研工作者進(jìn)一步探索。

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