兔大腸埃希氏菌的分離培養(yǎng)與鑒定

， ，，，，

(西藏自治區(qū)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009)

大腸埃希氏菌病是由致病性大腸埃希氏菌引起的一種急性腸道傳染病，新生和幼齡動物最易感染，以發(fā)生嚴(yán)重腹瀉、腸毒血癥、敗血癥為特征， 各種溫血動物都易感染患病。

兔大腸埃希氏菌病又名粘液性腸炎。本病是由一定血清型的致病性大腸埃希氏菌及其毒素引起的一種發(fā)病率、死亡率很高的腸道傳染性疾病。

1 流行病學(xué)

本病多發(fā)于初生和斷乳期仔兔，致死率很高。青年兔和成年兔的發(fā)病率和死亡率較低。近年來，各地兔場相繼爆發(fā)大腸埃希氏菌病，發(fā)病率高達(dá)50%～80%，個(gè)別兔場死亡率在50%以上，給養(yǎng)兔業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

帶菌動物通過排泄物或分泌物，將病原菌排出體外，污染飼料、飲水、墊草、場地用具等而傳播，傳播途徑主要是消化道。另外當(dāng)動物機(jī)體抵抗力下降、腸道內(nèi)菌群失調(diào)時(shí)，原來的常住菌便迅速繁殖，毒力增強(qiáng)，導(dǎo)致內(nèi)源性感染。該病也可繼發(fā)于球蟲及其他疾病。

本病一年四季均可發(fā)生，尤以高溫高濕的夏季和秋季多發(fā)。飼養(yǎng)管理不良，突然改變飼料，飼料中的粗纖維含量低，飼料污染，氣候突變、衛(wèi)生條件差等環(huán)境應(yīng)激導(dǎo)致腸道正常微生物菌群改變，使腸道常住的大腸埃希氏菌大量繁殖而發(fā)病。

2 臨床癥狀

病兔精神沉郁，被毛粗亂，體溫略高，食欲減退或廢絕，飲水量增加，腹脹，腹瀉，糞便中有膠凍樣黃白色黏液，呈腥臭味，肛門周圍被毛臟亂，粘有黃色水樣稀糞；部分病兔便秘，糞便帶有黏液，質(zhì)地堅(jiān)硬，病兔消瘦并嚴(yán)重脫水。最急性病例突然死亡而不顯任何癥狀。

初生仔兔常呈急性經(jīng)過，腹瀉不明顯，排黃白色水樣糞便，腹部臌脹，多在1～2 d內(nèi)死亡。未斷奶仔兔和幼兔多發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，排出淡黃色水樣糞便，帶有大量膠樣粘液和部分兩頭尖的干糞。

3 病理變化

病死兔腹部明顯膨大，病變主要在消化道，以回腸、回盲部和結(jié)腸部最為嚴(yán)重。

對病死仔兔進(jìn)行解剖，可見胃、十二指腸和空腸充滿多量氣體和液體而顯膨大，黏膜上有針尖狀出血點(diǎn)；膽囊脹大、十二指腸黃染。回腸內(nèi)容物呈粘液膠凍樣，空腸和回腸黏膜脫落。結(jié)腸擴(kuò)張，黏膜充血，有少量出血斑點(diǎn)和透明粘液。直腸糞球細(xì)長，兩頭帶尖，外面包有粘液，部分包有一層灰白色膠凍樣分泌物；回腸和結(jié)腸的淋巴濾泡腫大，腸系膜淋巴結(jié)顯著腫大。

初生仔兔急性死亡，腹部膨大，胃內(nèi)充滿白色凝乳物，并伴有氣體；膀胱內(nèi)充滿尿液、膨大；小腸腫大、充滿半透明膠凍樣液體，并有氣泡。可見肝臟腫大而質(zhì)脆，表面有點(diǎn)狀或片狀灰黃色壞死灶，腎臟有出血點(diǎn)，個(gè)別肺部出現(xiàn)點(diǎn)狀或片狀出血。

4 實(shí)驗(yàn)室檢查

4.1動物接種 采集自然病死兔的肝、脾、腎、心和肺部病料，將病料制成1∶5勻漿，加入青霉素和鏈霉素各5 000 IU/mL，置4℃冰箱中培養(yǎng)2 h，用滅菌注射器吸取培養(yǎng)后的勻漿，每只實(shí)驗(yàn)兔肌內(nèi)注射1 mL。觀察14 d，接種兔精神、食欲、糞便未見異常，健康存活。

4.2形態(tài)觀察 采集病料進(jìn)行涂片或觸片，用革蘭氏染色液進(jìn)行染色、鏡檢。可見大量紅色、兩端鈍圓、呈單個(gè)散在排列，不形成芽胞的G-球桿菌。

4.3分離培養(yǎng) 在凈化工作臺上，分別無菌采集心血、肝、脾、肺和腎接種于普通肉湯、熟肉基、鮮血瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)20 h，取培養(yǎng)物作革蘭氏染色鏡檢。普通肉湯和熟肉基上，細(xì)菌生長，液體渾濁；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，生長出粉紅色菌落。鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，生長出直徑約2 mm，菌落圓形、邊緣整齊、表面光滑、隆起、濕潤的淡灰色菌落，菌落不溶血。

再將革蘭氏陰性的5個(gè)單個(gè)菌落分別進(jìn)行純培養(yǎng)。置37℃培養(yǎng)20 h，取純培養(yǎng)物做涂片、干燥、固定和革蘭氏染色、鏡檢。可見到兩端鈍圓的G-球桿菌。

4.4生化試驗(yàn) 吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)陽性，甲基紅(MR)試驗(yàn)陽性，硫化氫試驗(yàn)陽性，能使葡萄糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵乳糖、蔗糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

4.5致病性試驗(yàn) 用滅菌生理鹽水洗下純培養(yǎng)物，制成懸液，接種實(shí)驗(yàn)兔，肌內(nèi)注射0.5 mL/只，觀察致病情況。可見實(shí)驗(yàn)兔體溫升高(40.0～41.0℃)，精神不振，食欲廢絕。糞便干硬并帶有黏液，且于接種后24～48 h衰竭死亡。剖檢病死實(shí)驗(yàn)兔，可見內(nèi)臟器官呈敗血癥的病理變化。從病死兔的心血、肝、脾、肺、腎臟中再次分離得到該菌。

4.6血清學(xué)試驗(yàn) 菌液與大腸埃希氏菌陽性血清出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；與沙門氏菌屬診斷血清不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；與陰性血清的對照未見菌體自凝現(xiàn)象。

5 討 論

5.1分離菌株呈革蘭氏陰性，兩端鈍圓，多散在，肉湯中有灰白色沉淀。分離菌接種健康兔均表現(xiàn)為不同程度的腹瀉、甚至死亡，表明兔群以腹瀉為主的疾病多系致病性大腸埃希氏菌所致。

5.2據(jù)試驗(yàn)，分離菌均能使乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇分解。同時(shí)，經(jīng)硫化氫試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅(MR)試驗(yàn)結(jié)果為陽性，與大腸埃希氏菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)特征基本一致。

5.3飼養(yǎng)管理不良極易導(dǎo)致本病的發(fā)生。因此，養(yǎng)兔場應(yīng)加強(qiáng)平時(shí)的飼養(yǎng)管理，注意通風(fēng)、保溫、消毒，以防大腸埃希氏菌病的發(fā)生。

5.4兔大腸埃希氏菌病是斷奶仔兔的常見多發(fā)傳染病，一般都是單一發(fā)病，混合感染較為少見，由于基層條件所限和兔群發(fā)病迅猛，為了盡快控制疫情擴(kuò)散，主要根據(jù)發(fā)病兔群流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖解變化和鏡檢情況即可初步診斷為兔大腸埃希氏菌病感染，經(jīng)綜合防治，效果明顯，為今后該病的防治工作積累了經(jīng)驗(yàn)和奠定了基礎(chǔ)。