短時重復游泳調節SAM8鼠AMPA受體GluR1亞單位的磷酸化

呂媛媛 趙 麗 王德剛 (北京體育大學運動人體科學學院，北京 100084)

短時重復游泳調節SAM8鼠AMPA受體GluR1亞單位的磷酸化

呂媛媛 趙 麗 王德剛 (北京體育大學運動人體科學學院，北京 100084)

目的 觀察短時重復游泳訓練對SAM鼠AMPA受體GluR1亞單位磷酸化的影響，探討運動改善腦功能的可能機制。方法 選取3月齡SAMP8(prone/8)亞系為研究對象，運動模型采用2 w游泳方案：2次/d，每次6 min的游泳，結束后給予浴巾擦干放回鼠籠;對照組則在相同時間每天給予兩次相同的浴巾安撫刺激。采用Western印跡方法，檢測SAM8鼠海馬和皮層AMPA受體GluR1亞單位Ser831和Ser 845位點的磷酸化水平的變化。結果 SAMP8海馬、皮層中AMPA受體GluR1亞單位Ser831和Ser845磷酸化水平與對照組相比均增加(P＜0.05)。結論 2 w的短時間重復游泳運動作為一種應激誘導劑促進了AMPA受體的活化，這可能是運動改善腦功能的機制之一。

游泳;GluR1;磷酸化作用;SAM8鼠

快速老化小鼠(SAM)8和SAM10可作為自然發病的老化癡呆鼠模型，它們除具有阿爾茨海默病(AD)明顯學習記憶障礙的特點和諸多神經病理特征外，尚可出現一些神經遞質和自由基代謝方面的病理改變。在腦內眾多參與學習記憶的神經遞質中，谷氨酸是重要的興奮性神經遞質，其受體有促離子型和促代謝型兩大類，其中促離子型α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)受體在信號傳導、神經生長發育和突觸可塑性(包括學習記憶)等方面都起著非常重要的作用。AD的病因和病理機制復雜，缺乏體力運動或受教育程度低等社會因素都明顯增加AD的發生率〔1，2〕，而對AD早期病人無論是社會、運動或心理因素的干預都可以減輕癡呆程度、利于記憶恢復〔3，4〕，但其保護機制目前并不清楚。本研究觀察短時重復游泳訓練的運動干預方式對SAM8小鼠腦內AMPA受體活化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物由中國醫學科學院實驗動物中心提供，健康雄性、清潔級3月齡SAMP8小鼠16只，體重25～30 g。GluR1的S831和S845抗體購于Abcam公司;β-actin抗體及IgGA二抗購自Proteintech公司;標準分子量蛋白Marker購自biolab公司;PVDF膜購自Millipore公司;PMSF(苯甲基磺酰氟化物)、DTT、考馬斯亮藍 G-250、BSA、Tris(三羥甲基氨基甲烷)購自Amresco公司;Stripping Buffer購自北京華肽先鋒生物科技有限公司;磷酸酶抑制劑購自Roche公司。

1.2 實驗儀器

本實驗所使用的移液器(Eppendorf，德國)，組織勻漿器(Staufen，德國)，721型可見光分光光度計(上海菁華)，紫外可見光分光光度計(島津，日本)，低溫高速離心機(Beckman，美國)，電泳儀(北京六一儀器廠)，自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，數字式酸度計(E-201-C9型)(上海理達儀器廠)均由北京體育大學科學實驗中心所提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 運動模型 選取16只3月齡SAMP8(prone/8)亞系作為研究對象，由于此種系小鼠攻擊性很強，為了避免打架造成的傷亡，分籠飼養，自由飲食、飲水，室溫(25±2)℃。適應性飼養及游泳運動3 d后正式入組，盡可能同窩鼠隨機分入對照組和實驗組，每組8只，游泳組方案參照Shaomin Li的2 w游泳方案〔5〕。游泳組進行每天兩次，每次6 min的游泳，結束后給予浴巾擦干放回鼠籠;對照組則在相同時間每天給予兩次相同的浴巾安撫刺激。最后一次游泳訓練結束后48 h內麻醉小鼠分別取皮層和海馬組織。

1.3.2 測試方法 取小鼠的海馬和皮層各100 mg，加入1 ml胞漿裂解液，于冰水浴中電動勻漿，靜置30 min后，離心30 min，取上清液分裝，存于-80℃冰箱待測。采用Bradford法測定總蛋白含量，計算好上樣量后，調整蛋白濃度，于100℃加熱5 min，使蛋白充分變性。蛋白經SDS-PAGE電泳轉至PVDF膜上，經5%BSA室溫封閉60 min后，加入一抗(GluR1的S831和S845 位點抗體1∶500，β-actin抗體1∶1 000)，室溫下孵育60 min后，4℃過夜。次日將PVDF膜用PBST洗3×10 min后，加入二抗(三種蛋白二抗濃度均為1∶4 000)孵育60 min，用PBST洗3×10 min后，于暗室用ECL發光液顯影，曝光。膠片經生物電泳圖像分析系統掃描后，分析灰度值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 短時重復游泳訓練對SAM8小鼠海馬、皮層中GluR1-Ser845位點磷酸化的影響

SAM8+運動組小鼠海馬、皮層中GluR1-Ser845位點的磷酸化較對照組相比均增加(3.46±0.47，1.42±0.13，P ＜0.05)，其中海馬中 GluR1-Ser845 磷酸化水平明顯增加是對照組的3.46倍(P＜0.01)。

2.2 短時重復游泳訓練對SAM8小鼠海馬、皮層中GluR1-Ser831位點磷酸化的影響

SAM8+運動組小鼠海馬、皮層中GluR1-Ser831位點的磷酸化較對照組相比均增加(1.24±0.11，2.12±0.36，P＜0.05)，其中皮層中 Ser831磷酸化水平明顯增加是對照組的2.12倍(P＜0.01)。

3 討論

運動作為一種特殊的干預手段，其在慢性心血管疾病、2型糖尿病、癌癥、癡呆等與年齡相關聯的一些疾病中的積極作用已多有報道〔6～8〕。但來自于不同實驗室的研究證明不同運動模式及運動強度對不同群體的作用也不盡一樣。對嚙齒類動物來講游泳運動是一種緊張性應激刺激，依據刺激強度不同游泳運動可使小鼠海馬長時程增強(LTP)增強或降低，LTP被認為是在細胞水平參與學習和記憶的形成。比如10 min的游泳會削弱LTP的形成，15 min的游泳則起到了抑制LTP的作用，而2 min的游泳能使早期的 LTP轉變成晚期 LTP〔9，10〕。Li等〔11〕的研究發現應激程度不同即運動模式不同，對海馬學習和突觸可塑性產生或促進或抑制LTP形成的作用，其應答的復雜性與富集環境刺激的實驗相似，如持續的新穎暴露會損傷LTP的建立，而短時新穎探索則促進海馬LTP誘導。

LTP維持的形成機制與興奮性突觸后電位的AMPA成分持續性增強有關。突觸后AMPA電流增強的原因之一是突觸后膜上AMPA受體功能活動的增強，突觸后膜上AMPA受體因發生磷酸化而功能活動增強，出現電導加大或開放概率增加。AMPA受體是GluR1～GluR4 4個亞單位組成的多聚體，在所有AMPA受體亞單位中，GluR1對于成熟動物海馬LTP的建立非常重要。研究報道AD病人海馬區域GluR1水平下降了43%〔12〕，提示突觸后膜AMPA受體功能的改變與AD認知障礙的發生有關。在AMPA受體中主要起作用的是GluR1C末端的絲氨酸磷酸化，GluR1有兩個主要的磷酸化位點，Ser831和Ser845，它們的磷酸化作用可改變AMPA受體的功能，對于各種形式的突觸可塑性以及空間記憶的維持有重要的作用。與我們的研究結果相類似的有Levine等〔13〕的研究發現大鼠跑輪運動能夠誘導海馬齒狀回腦源性神經生長因子(BDNF)、AMPA受體的表達升高，同時能夠降低LTP閾值、促進神經元的生長。

綜上所述，本實驗所采用的游泳方案對SAM8鼠是一種良性應激刺激，可誘導參與學習記憶的海馬和皮層中AMPA受體通道的磷酸化程度增加，使得突觸活動功能增強，這可能是運動改善AD患者腦功能的機制之一。同時說明在改善腦功能時運動作為一個干預手段，其運動強度要求并不大，達到陽性刺激即可，與我們之前提出的運動毒理學效應〔14〕相一致。

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14 趙 麗，熊開宇，王正珍，等.運動與毒物興奮效應〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(11)：2134-6.

A transient，but repeated swimming regulating the GluR1 phosphorylation of AMPA receptor in SAM8 mice

Lü Yuan-Yuan，ZHAO Li，WANG De-Gang.
College of Science of Sport and Human Body，Beijing Institute of Physical Education，Beijing 100084，China

Objective To investigate the effects of a transient，but repeated swimming on the GluR1 phosphorylation of AMPA receptor in SAM8 mice，and explore the possible molecular mechanisms for exercise improving brain function.Methods 16 male SAM8 mice were equally randomized into normal and swimming groups.Swimming protocol was conducted twice a day for 6 min，each for a total of 14 days.After swimming，the mice were dried with a towel and placed back into their original cage.A control group of animals was handled for 6 s，wrapped in a towel twice a day for 14 days to simulate the handle after swimming.The phosphorylation of GluR1 at Ser831 and Ser845 were measured by Western blot.Results Compared with normal group，both in cortex and in hippocampus，the phosphorylation degree of GluR1 at Ser831 and Ser845 were significantly increased(allP＜0.01).Conclusions 2-week swimming protocol may be a stress inducer which lead to the activation of AMPA receptor，and that may be the one of mechanisms of exercise benefiting brain function.

Swimming;GluR1;Phosphorylation;SAM8

Q419

A

1005-9202(2012)14-2962-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.14.027

國家自然科學專項基金資助項目(31040044);高等學校學科創新引智計劃資助項目(B08045)

趙 麗(1970-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事運動與神經可塑性研究。

呂媛媛(1984-)，女，助理實驗師，碩士，主要從事運動與神經可塑性研究。

〔2011-11-18收稿 2011-12-20修回〕

(編輯 曹夢園)