干細胞旁分泌效應在ALI/ARDS治療中的研究進展*

朱 峰， 文輝才， 郭光華

(南昌大學第一附屬醫院1重癥醫學科，2整形科，3燒傷科，江西 南昌 330006)

1000-4718(2012)04-0755-05

2011-11-10

2012-02-24

國家自然科學基金資助項目(No.81060155)；江西省科技廳支撐計劃(No.2010BSA10300)

△通訊作者 Tel:0791-88692533；E-mail：guogh2000@hotmail.com

干細胞旁分泌效應在ALI/ARDS治療中的研究進展*

朱 峰1， 文輝才2， 郭光華3△

(南昌大學第一附屬醫院1重癥醫學科，2整形科，3燒傷科，江西 南昌 330006)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)以及它的嚴重形式——急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是危重病人發病和死亡的重要原因之一，最近2個世紀以來，死亡率仍在36%～44%左右[1]。ALI/ARDS的病因眾多，發病機制十分復雜，涉及的環節多，受損的靶細胞多，主要涉及的環節有：炎癥反應失控、細胞損傷與修復、細胞凋亡與增殖、纖溶與凝血等多個層面，這些層面彼此關聯形成復雜的細胞網絡和細胞因子網絡。其中炎癥反應失控是本質，而炎癥反應失控所導致的彌漫性肺泡上皮損傷和肺內微血管內皮細胞損傷是疾病的主要病理特征。

隨著ALI/ARDS發病機制研究和對機械通氣并發癥認識的深入，非機械通氣手段作為重要的輔助治療手段也越來越受到重視。其中，干細胞治療ALI/ARDS的研究就是近年來頗受關注的一個領域[2-3]。研究證實，肺外干細胞具有抗炎和免疫調節作用，能改善ALI/ARDS肺內及全身的炎癥反應；能“歸巢”至損傷區域，向肺內多種功能細胞分化并發揮相應功能參與肺組織的修復作用[4-6]。筆者的研究小組在骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)移植治療煙霧吸入性損傷的研究中證實，MSCs能顯著降低其全身和局部主要促炎因子水平，升高抗炎因子水平，減少血管外肺水含量，升高肺組織局部血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)水平，減輕肺和氣管組織損傷程度；能“歸巢”至損傷和炎癥反應明顯的肺組織和支氣管組織區域并分化為肺泡Ⅰ型上皮細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞以及肺血管內皮細胞，參與并加快煙霧吸入性損傷的組織修復過程[7-9]。

隨著干細胞治療ALI/ARDS研究的深入和學術中出現的一些有爭議問題，使MSCs治療的機制研究愈來愈受到關注。MSCs在體外經誘導可以分化為骨、軟骨、骨骼肌、心肌、血管內皮、神經膠質細胞、胰島素分泌細胞等3個胚層的組織細胞，因此MSCs移植入體內分化為功能細胞替代受損細胞被認為是最主要機制。但隨著對MSCs特點的深入研究，對該機制的爭議頗多[10]，例如在MSCs治療ALI的急性期即有血管外肺水腫和炎癥因子、VEGF水平的改善，而MSCs在短時間內分化為功能細胞并發揮功能的可能性極小。因此，分化以外的某個機制可能成為MSCs治療ALI的主導機制。相關領域研究證實MSCs旁分泌可溶性因子的能力可能是MSCs發揮作用的重要機制[11]。這些旁分泌的因子通過組織間隙作用于周圍細胞，發揮重要的旁分泌作用(paracrine)，廣泛參與免疫調節、細胞增殖、凋亡、內源性前體細胞再生、血管再生以及通過釋放生長因子來改變內皮細胞或上皮細胞對損傷的反應等病理生理作用，被認為是MSCs起修復作用的重要機制之一[10]。

近年來，研究者們已經注意到了干細胞的旁分泌效應在ALI/ARDS治療中的作用[11]，并有數個研究證實了干細胞的這一重要治療機制[12-14]，認為MSCs干預肺疾病的病理生理過程不僅是通過其可塑性(plasticity)，還有旁分泌效應[15]。這個機制最早是由Ortiz等[16-17]證實的，他們在ALI和肺纖維化的動物模型中觀察發現，全身給予MSCs能抑制幾種促炎因子和促纖維化因子的表達。

MSCs可能旁分泌的物質主要有：(1)生長因子及其受體，包括血管生成素(angiopoietin, Ang)-1/2、VEGF、成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、轉化生長因子-β、胎盤生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板源生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子等在內的多種生長因子等；(2)細胞因子和趨化因子，包括白細胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)以及單核細胞集落刺激因子、單核細胞趨化蛋白-1等；(3)調節肽以及其它一些相關分子,包括鈉尿肽、降鈣素基因相關肽、局部腎素-血管緊張素系統、內皮素和腎上腺髓質素等在內的多種調節肽以及一些特異性活性因子，包括干細胞因子、干細胞衍生因子、干細胞衍生的神經干/祖細胞支持因子等。這些干細胞旁分泌的物質在ALI/ARDS的治療中發揮著十分重要的作用，具體表現如下。

1 抗炎和免疫調節

MSCs旁分泌的許多可溶性因子中均具有抗炎和免疫調節作用，包括IL-1受體拮抗劑、IL-10、前列腺素E2、TNF-α刺激蛋白6(TSG6)、吲哚2,3雙加氧酶等[16, 18-20]。Rojas等[21]證實，MSCs能減輕肺組織對LPS誘導的炎癥反應并保護肺免受損傷。研究顯示，在LPS攻擊后6-48h內，MSCs能防止肺水腫產生，減輕中性粒細胞在肺內的浸潤，明顯降低血漿前炎癥因子如IL-1β、IFN-γ、巨噬細胞炎癥蛋白-lα(MIP-1α)水平，保持抗炎因子IL-10和粒細胞集落刺激因子水平的穩定，促其急劇升高。深入研究還證實了受損肺細胞能誘導MSCs的遷移，而MSCs能在受損肺細胞內調節炎癥信號過程[22]。同時，通過評價受損肺組織20 201個基因之間相互關系，他們還證實了在內毒素血癥期間MSCs調節的可能信號途徑和基因網絡并繪制其相關圖譜[23]。Gupta等[19]研究表明，肺內給予內毒素致ALI后4 h再給予MSCs，能改善實驗大鼠48 h存活率，減少肺水和支氣管肺泡灌洗液中的蛋白含量，并認為這是由于MSCs能下調內毒素所致的前炎癥反應(降低支氣管肺泡灌洗液、血漿中的TNF-α)和MIP-2，升高抗炎因子IL-10。因此，肺內給予MSCs能顯著降低內毒素誘導ALI的嚴重程度，改善其預后。蔡存良等[24]經靜脈移植MSCs到內毒索攻擊致ALI的大鼠體內發現，MSCs移植能降低內毒素性肺損傷大鼠血漿TNF-α及IL-6水平，降低肺濕/干重比值、髓過氧化物酶活性，減輕肺泡炎癥損傷。表明MSCs移植對ALI大鼠有保護作用。

2 肺泡液體清除(alveolar fluid clearance, AFC)

AFC功能受損在ALI/ARDS患者中很常見，AFC功能損害程度對判斷發病率和死亡率具有顯著的預后價值[25]。研究顯示，肺水腫液含有多種高濃度促炎因子，包括IL-1β、IL-8、TNF-α和TGF-β1[26]，其中幾個促炎因子在上皮液體轉運中發揮著重要作用，特別是對鈉通道(ENaC α、β、γ)和鈉鉀ATP酶。據知，MSCs能旁分泌多種上皮特異性生長因子，特別是角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)。在大鼠肺內，MSCs通過上調αENaC表達和鈉鉀ATP酶活性來改善肺泡液體轉運能力[27-28]。在內毒素誘導的ALI中，自支氣管內滴入MSCs 后1h，AFC得到明顯改善，這被部分地認為是因為MSCs旁分泌了KGF[29]，KGF提高了肺泡上皮細胞的液體運輸。

3 修復和改善受損肺泡毛細血管屏障結構和功能障礙

肺內微血管內皮系統的完整性對防止富含蛋白的液體和炎癥細胞從血漿涌入肺泡是至關重要。幾個主要的MSCs旁分泌因子在這方面起著重要的作用，例如Ang-1、干細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)和KGF。Ang家族中的Ang-1不僅針對血管內皮細胞，還可以促進內皮細胞周圍支持細胞的聚集，包括小血管的外膜細胞、大血管的平滑肌細胞。通過內皮周圍支持細胞的聚集，包裝內皮管道，不僅可以維持血管結構的完整性，還能有效防止炎癥及 VEGF所致的血管通透性增加，減少滲出水腫，使新生血管結構完整，具有維持血管穩定、抗血管滲漏、抗凋亡、抗炎、促進淋巴管形成及組織液回流、減少水腫等功能。研究顯示，HGF通過抑制Rho GTP酶活性，阻止肌動蛋白應力纖維形成和因凝血酶損害肺內皮細胞的細胞旁隙加大來穩定和維持肺內皮系統的完整性[30-31]。而在各種原因導致的急性通透性水腫的動物模型中，例如α-萘硫脲、綠膿桿菌以及呼吸機相關性肺炎，KGF能減輕肺水腫并減少肺泡灌洗液中蛋白的含量[32-34]。

4 趨化其它細胞參與組織修復

研究者們曾假設MSCs可能在體內分化為肺內皮細胞和上皮細胞以達到修復受損肺組織的目的。但是，這一假設被多個研究團隊所質疑，因為他們觀察到肺損傷模型中低于1%的MSCs移植率[35-36]，因此，移植以及分化不認為是MSCs治療ALI/ARDS的主要作用機制，其主要作用機制被認為是“歸巢”至肺損傷區域，與宿主細胞的相互作用以及旁分泌可溶性因子調節炎癥反應、改變肺上皮細胞和內皮細胞對損傷的反應。雖然MSCs在有限的移植率和短時間內難以通過分化修復受損肺組織，但其旁分泌的趨化因子能吸引其它細胞參與修復。 Honczarenko等[37]發現，當人MSCs培養于無血清的特殊培養基時，能有效分泌趨化因子CCL2 (MCP-1)、CCL4 (MIP-1b)、CCL5 (RANTES)、CCL20 (MIP-3a)、CXC亞族的CXCL12 (SDF-1)、CXCL8 (IL-8)和CX3C亞族的CX3CL1。除了上述報道的外，還包括CXC亞族的CXCL1-3 (GRO)、CXCL5 (ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL10 (IP-10)。由于趨化因子和趨化因子受體的作用，使MSCs能夠在體內進行定向游走。CCR2和CXCR4分別是MCP-1和基質細胞來源因子(SDF-1)的受體，表達于MSCs表面。據報道，MSCs移植促進伴有局部放射損傷創面愈合的可能機制就是植入的MSCs所分泌的趨化因子IL-8聯合IL-6、TNF-α等細胞因子有效促進了傷口周圍包括中性粒細胞、嗜堿性粒細胞及T細胞在內的多種炎癥細胞和修復細胞向創面移行、增殖、及早啟動修復，增加了局部修復細胞的數量[38]。

5 抗菌作用

細菌性肺炎和肺外感染導致的肺損傷是ALI/ARDS常見的病因。體內實驗顯示，MSCs對細菌感染引起的敗血癥具有保護作用，能改善生存率和提高體內細菌的清除能力[39]。Gonzalez-Rey等[40]的研究證實，脂肪干細胞通過抑制炎癥和Th1細胞的反應對小鼠結腸炎和敗血癥具有保護作用。Krasnodembskaya等[41]的實驗結果顯示，人MSCs通過旁分泌抗菌多肽LL-37，參與了對G-細菌的先天免疫反應。然而，在這些研究中，研究者們均沒有提出確切的機制。

6 其它

MSCs旁分泌因子還具有促進血管生成、抗凋亡、代謝、防御反應和組織分化等作用，但目前關于這方面的研究還很少，不成系統，尚需進一步探索。

目前干細胞治療ALI/ARDS的研究興趣多集中在其旁分泌效應上。研究顯示，移植入體內的干細胞能分泌諸如生長因子、細胞因子等作用于肺組織，發揮抗炎-免疫調節、促進組織修復、改善內皮和上皮通透性、修復AFC功能以及抗菌作用，是干細胞治療ALI/ARDS以及在臨床應用的重要理論基礎，也是應用基因工程技術表達干細胞相關因子治療ALI/ARDS的前提，值得重視。然而，鑒于這些研究結果主要集中在動物實驗，無臨床應用數據；干細胞旁分泌具體作用機制不詳以及基因治療ALI/ARDS研究的剛剛興起，深入的研究尚需進一步開展。總之，作為一項新興技術，干細胞移植治療ALI/ARDS仍有著廣闊前景。

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Paracrineeffectofstemcellsontreatmentofacutelunginjury/acuterespiratorydistresssyndrome

ZHU Feng1, WEN Hui-cai2, GUO Guang-hua3

(1DepartmentofCriticalCareMedicine,2DepartmentofPlasticSurgery,3DepartmentofBurning,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:guogh2000@hotmail.com)

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent the leading cause of morbidity and mortality in critical patients. Despite improvements in supportive care and mechanical ventilation, recent data indicate that the mortality of ALI/ARDS is still high. Cell-based therapy with stem cells is an attractive new therapeutic approach. Stem cells have the capacity to secrete multiple paracrine factors that can regulate inflammation, improve alveolar fluid clearance, regulate endothelial and epithelial permeability, enhance tissue repair via chemotaxis and inhibit bacterial growth. This review focuses on the recent studies, which support the potential therapeutic use of stem cells in ALI/ARDS with an emphasis on the role of paracrine soluble factors.

干細胞; 急性肺損傷; 呼吸窘迫綜合征，急性

Stem cells; Acute lung injury; Respiratory distress syndrome,acute

R563

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.033