miR-125b在兒童AML中的表達及其反義寡核苷酸對白血病細胞的作用*

劉曉丹， 徐 令， 檀衛平， 顏慕霞

(中山大學孫逸仙紀念醫院1醫學研究中心，3兒科, 廣東 廣州 510120；2廣州市婦女兒童醫療中心血液科，廣東 廣州 510623)

1000-4718(2012)04-0738-04

2011-11-01

2011-12-27

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2011010004731)

△通訊作者 Tel:020-38076603; E-mail: luoxul64@yahoo.com

miR-125b在兒童AML中的表達及其反義寡核苷酸對白血病細胞的作用*

劉曉丹1， 徐 令2△， 檀衛平3， 顏慕霞2

(中山大學孫逸仙紀念醫院1醫學研究中心，3兒科, 廣東 廣州 510120；2廣州市婦女兒童醫療中心血液科，廣東 廣州 510623)

目的研究兒童急性髓細胞白血病(AML)患者骨髓細胞中miR-125b的表達及miR-125b為靶標的反義寡核苷酸對人白血病細胞的作用。方法采用基因芯片和實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)檢測兒童AML治療前后骨髓細胞中miR-125b的表達。采用電轉法將與miR-125b序列互補的反義寡核苷酸轉染HL-60細胞，細胞計數試劑盒(CCK-8)檢測轉染后24 h、48 h、72 h、96 h細胞增殖情況。結果芯片結果顯示miR-125b在兒童AML中表達明顯增高，約為正常的12倍，qRT-PCR結果進一步證實了miR-125b在兒童AML中異常高表達，同時還發現miR-125b在兒童AML部分緩解的患者骨髓細胞中表達下降，在完全緩解患者骨髓細胞中降至正常水平。CCK-8結果顯示，針對miR-125b的反義寡核苷酸能有效抑制白血病細胞的增殖，與對照組相比有顯著差異(P<0.01)。結論miR-125b在兒童AML中可能起“癌基因”作用，以miR-125b為靶標的反義寡核苷酸可能為兒童AML治療提供新的方法。

miR-125b； 寡核苷酸類，反義； HL-60細胞

白血病是兒童時期最常見的惡性腫瘤，15歲以下兒童白血病的發病率為4/10萬左右，約占該時期惡性腫瘤的35%。隨著聯合化療和造血干細胞移植技術的應用，兒童白血病的存活率大為改觀，但急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)的預后仍很差，5年存活率僅40%～50%[1]。因此，進一步闡明AML發病的分子機制，尋找新的治療方法具有重要的意義。

長期以來，對AML分子機制的研究主要著眼于染色體異常以及蛋白編碼基因，近年來發現非編碼的microRNA(miRNA)與癌癥的發生、發展、臨床表現和預后都有密切的關系，在其中起著“促癌”或“抑癌”作用[2-6]。miRNA是一類廣泛存在于動物和植物等多細胞生物中約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，它通過與靶基因mRNA的3'-UTR區域部分或完全配對，引起mRNA切斷或轉錄抑制，介導轉錄后基因沉默，從而在生物許多功能基因調控網絡中起著非常重要的作用[7]。如何發現與腫瘤相關的miRNA，闡明其作用及調控機制，將它們整合到基因調控網絡中是分子醫學研究的熱點和前沿。

miRNA與白血病發生發展及預后也密切相關，近年來在各國科學家的努力下，白血病相關miRNA的研究取得了很大的進展，各型白血病miRNA的表達譜被相繼報道，部分白血病相關的miRNA功能及其調控機制也被闡明。如Cimmino等[8]證實 miR-15a/16-1可以通過下調靶基因 B 細胞淋巴瘤2(BCL2)的表達來誘發白血病細胞的凋亡，從而發揮其抑癌基因的功能；Venturini等[9]報道慢性髓細胞白血病中很可能存在著BCR-ABL-c-Myc-miR-17-92通路的病理生理學機制。盡管在白血病相關的miRNA功能及其調控機制方面取得了重要進展，但仍有很多功能、機制沒有完全闡明，特別是對兒童白血病的研究還少見報道。而兒童白血病的生物特性在臨床、病理組織及生物學方面與成人不同[1]，因此有必要特別針對兒童白血病，特別是AML相關的 miRNA的作用及其機制進行研究，其作用和機制的闡明可能為兒童白血病治療提供新的靶點。

本文利用miRNA芯片技術對兒童AML的表達譜進行了研究，結果顯示miR-125b在AML中的表達增高，提示它可能與兒童AML相關。在此基礎上，本文采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對患兒治療前后的miR-125b表達水平進行檢測，體內研究miR-125b是否與兒童AML 相關，同時設計針對miR-125b的反義寡核苷酸，作用于白血病細胞，通過檢測細胞增殖情況，研究miR-125b反義寡核苷酸對白血病細胞的作用，目的在于研究miR-125b的功能，其功能的闡明有利于揭示白血病中的“RNA調控網絡”，并可能為白血病的治療提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1臨床資料

93例AML患兒的骨髓標本(包括初治組75例，部分緩解組8例，完全緩解組10例)來源于中山大學附屬第一醫院和孫逸仙紀念醫院2006～2010年的住院病人，其中男54例，女39例，中位年齡8歲。全部病例均經骨髓細胞形態學、免疫分型、染色體、融合基因檢查確診。早幼粒細胞白血病基因與維甲酸受體α重排(promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor α，PML-RARα)陽性的急性早幼粒細胞白血病(即M3型)患兒誘導化療采用全反式維甲酸+米托蒽醌方案，其余的AML患兒誘導化療采用米托蒽醌+阿糖胞苷+順鉑方案。對照組采用特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)患兒，共12例，包括男7例，女5例，中位年齡6歲，AML患兒的詳細臨床資料見表1。本研究所有樣品的采集得到了中山大學道德倫理委員會的批準。

表1 AML患兒臨床資料

FAB：French-American-British classfication. M1：acute myelocytic leukemia without differentiation；M2：acute myelocytic leukemia with differentiation；M3：acute promyelocytic leukemia；M4：acute myelomonocytic leukemia； M5：acute monoblastic leukemia.

2miRNA基因芯片表達譜分析

按照說明書方法用RNAiso(TaKaRa)試劑提取兒童AML組及對照組骨髓細胞總RNA，用miRNA基因芯片(博奧，北京)進行miRNA微陣列分析。具體方法參考文獻[10]。

3細胞培養及轉染

人白血病細胞系HL-60購于中國科學院上海細胞庫。將細胞接種于10%胎牛血清(Gibco)、無抗生素的RPMI-1640培養基(Gibco)中, 置于37 ℃、5%CO2培養箱內常規培養。取對數生長期細胞用于實驗。細胞轉染時按照每孔1×106細胞，1 mL完全培養基，接種于24孔板中。與miR-125b成熟體互補的反義寡核苷酸(anti-miR-125b)及陰性對照(anti-miR-NC)購自廣州銳博公司。利用電轉系統(Neon? Transfection System，Invitrogen)將100 pmol anti-miR-125b和anti-miR-NC以10 μL體系轉染到細胞內。電轉染條件如下：1 350 V，30 ms，1 pulse。

4qRT-PCR驗證miR-125b的表達

采用RNAiso(TaKaRa)法分離純化各組臨床樣品的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。采用含有莖環樣的反轉錄引物(GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAAG)，按照M-MLV reverse transcriptase試劑盒(Promega)進行反轉錄，體系如下：總RNA 5 μL，miR-125b RT primer 1.8 μL，U6 RT primer 1.8μL，dNTP 5 μL，5×M-MLV reverse transcriptase buffer 6 μL，逆轉錄酶0.25 μL，RNA酶抑制劑 0.6 μL，補充DEPC水至30 μL。16 ℃孵育30 mim，42 ℃孵育45 min, 85 ℃加熱 5 min 失活逆轉錄酶，-4 ℃貯存。實時定量PCR按照SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒(TaKaRa)說明書操作。用Bio-Rad熒光PCR儀及其分析軟件iQ5進行PCR 擴增及定量分析。20 μL反應體系含cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×SYBR Mix 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，加水至20 μL。PCR循環：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共40個循環。每次擴增均設內參基因組和目的基因組以及2管空白對照組(由DEPC水代cDNA)。每一樣本均設3個重復。最后用2-ΔΔCt方法將與對照組對應的每一個miRNA表達進行分析，U6為內參照。實驗重復3次，包括無模板的空白對照。所用引物見表2。

表2 引物序列

5細胞增殖實驗

利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(碧云天)檢測細胞增殖。實驗按照產品說明書進行，具體是：用電轉法將等量的反義寡核苷酸anti-miR-125b和陰性對照anti-miR-NC轉染入細胞，接種于24孔板中培養。分別在轉染后24 h、48 h、72 h、96 h取出相同體積的細胞，接種于96孔板中，加入10 μL CCK-8，使用多功能酶標儀檢測450 nm的吸光值(A)，630 nm作為參比波長。按以下公式計算抑制率：抑制率(inhibition ratio，IR，%) =1-(實驗組平均A450-實驗組平均A630)/(對照組平均A450-對照組平均A630)×100%。

6統計學處理

結 果

1基因芯片檢測兒童AML中miR-125b表達增高

miRNA芯片對9例初發兒童急性白血病和3例正常骨髓中miRNAs的表達譜結果顯示，在兒童AML初發患者中，miR-100、miR-125b、miR-335明顯高表達。其中miR-125b在兒童AML中的表達增高，約為正常對照的12倍。

2miR-125b在兒童AML治療前后的表達情況

結果顯示,miR-125b在兒童AML中表達上調約16.6倍，其表達水平顯著高于正常組(P<0.01)，見圖1，與前期芯片的結果相符。miR-125b在8例部分緩解樣品中的表達降低，明顯低于初發AML樣品(P<0.01)，見圖1，而在10例完全緩解組中的表達更低，基本恢復到了正常組水平，與正常組相比差異無統計學意義(P>0.05),見圖1。

圖1ITP患者、初發AML患兒、部分緩解及完全緩解患兒miR-125b的差異表達

3anti-miR-125b抑制HL-60體外增殖

結果顯示，與miR-NC組相比，anti-miR-125b反義寡核苷酸組的HL-60細胞增殖活性明顯受到抑制。轉染24 h后，細胞被抑制的情況不是很明顯(抑制率為3.8%)，48 h后，對照組仍正常增殖生長，轉染了anti-miR-125b的實驗組則生長停滯，甚至有細胞數量減少的趨勢，48 h、72 h和96 h時，實驗組細胞增殖的抑制率分別是33.3%、52.9%和56.6%。該結果提示，anti-miR-125b顯著抑制HL-60細胞的增殖 (P<0.05)，見圖2。

圖2反義寡核苷酸anti-miR-125b對白血病細胞系HL-60增殖的影響

討 論

盡管目前對白血病的治療取得很大進展，仍有相當部分兒童白血病預后惡劣，因此，尋找白血病新的治療靶點，研發具有自主產權、毒副作用小的治療白血病的新藥具有重要的經濟價值和社會意義。隨著對miRNA功能以及調控機理研究的闡明，以miRNA為靶點的抗腫瘤寡核苷酸藥物的研發成為了國際上的研究熱點，它將區別于常規的腫瘤治療，成為新一代的腫瘤基因治療藥物。因此，闡明腫瘤相關miRNA的功能具有重要意義，它可能為腫瘤治療提供新的靶點[11-12]。

miR-125b是調控線蟲時空發育的miRNA——lin4的同源基因，它有2個不同的前體成員，分別是miR-125b-1和miR-125b-2。最新研究表明，AML中成熟的miR-125b主要來源于miR-125b-1[13]，而miR-125b-1前體位于11號染色體的脆性位點區[14]。隨著對miRNA研究的深入，miR-125b功能報道逐漸增多。它不僅在人類發育過程起作用，如miR-125b通過靶向調控靶基因DGAT1、SGPL1、TBC1D1等調節神經元細胞分化[15]；而且在癌癥發生中也發揮重要作用, Zhou等[16]最近報道miR-125b能通過靶向結合bak的3’-UTR區域，抑制其蛋白的轉錄后翻譯，從而促進乳腺癌細胞的增殖，抑制細胞凋亡。本研究通過芯片和實時熒光定量PCR技術對兒童急性髓系白血病患者中miR-125b的表達進行研究，發現miR-125b在兒童AML中顯著高表達，治療后部分緩解患者下降，而完全緩解的患者下降到正常水平，說明miR-125b很可能在兒童AML中發揮了重要作用。進一步對其功能進行研究發現，miR-125b的反義寡核苷酸小分子能夠有效抑制HL-60細胞增殖。本研究結果與Zhou等在乳腺癌中的研究結果相似，我們推測miR-125b很可能在兒童AML的發生中也起著癌基因作用，至于miR-125b是否也是通過抑制靶基因bak而發揮作用正在研究之中。

本文研究了miR-125b在兒童AML中的表達及功能，為利用反義核酸技術開展針對 miR-125b的靶向治療成為可能，從而為白血病的基因治療開辟新的途徑。但是腫瘤的發生、發展是一個多基因參與、逐步演化的復雜過程，因此對于miR-125b引起上述改變的具體機制和作用靶點還需進一步的研究，以期為理解腫瘤的發生、發展機制、尋找有效的腫瘤治療靶標和方法打下基礎。

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ExpressionofmiR-125binpediatricacutemyeloidleukemiaandtheeffectofanti-miR-125boligonucleotideonproliferationofhumanleukemiccells

LIU Xiao-dan1, XU Ling2, TAN Wei-ping3, YAN Mu-xia2

(1TheCenterofMedicalResearch,3DepartmentofPediatrics,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;2DepartmentofHematology,GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenter,Guangzhou510623,China.E-mail:luoxul64@yahoo.com)

AIM: To investigate the expression of miR-125b in pediatric acute myeloid leukemia (AML), and to explore the inhibitory effect of anti-miR-125b oligonucleotide on human leukemic cells.METHODSThe expression of miRNAs in pediatric AML bone marrow cells was analyzed by gene microarray and real-time quantitative PCR. HL-60 cells were transfected with anti-miR-125b, which was complementary to miR-125b in sequence, and the viability of HL-60 cells was measured by CCK-8 assay 24 h, 48 h, 72 h and 96 h after electroporation.RESULTSThe expression levels of miR-125b in the cells of newly diagnosed pediatric AML patients was almost 12 times as high as that in the cells of idiopathic thrombocytopenic purpura cases.However， the decreased levels of miR-125b in the cells of partial remission patients and returned to normal in the cells of completely remission patients were observed. At the same time, the growth rate of the cells treated with anti-miR-125b oligonucleotide was obviously decreased compared with that of control cells.CONCLUSIONmiR-125b may take effect as an oncogene in pediatric AML. Anti-miR-125b oligonucleotide may be useful as a new drug for treating pediatric AML.

miR-125b; Oligonucleotides,antisense; HL-60 cells

R342.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.029