辛伐他汀對香煙煙霧提取物誘導的人臍靜脈內皮細胞表達sEPCR和mEPCR的影響*

樊芳芳， 胡曉蕓， 扈麗娟， 韓葆芬， 趙瑛娟

(山西醫科大學第一醫院呼吸內科，山西 太原 030001)

1000-4718(2012)04-0727-03

2011-10-17

2011-12-31

山西省衛生廳科技攻關計劃項目(No.20100201)

△通訊作者 Tel：0351-4639901；E-mail：huxiaoyunly@sina.com

辛伐他汀對香煙煙霧提取物誘導的人臍靜脈內皮細胞表達sEPCR和mEPCR的影響*

樊芳芳， 胡曉蕓△， 扈麗娟， 韓葆芬， 趙瑛娟

(山西醫科大學第一醫院呼吸內科，山西 太原 030001)

目的研究辛伐他汀對香煙煙霧提取物(CSE)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs) 表達可溶性內皮細胞蛋白C受體(sEPCR)和膜聯內皮細胞蛋白C受體(mEPCR)的干預作用。方法體外培養的4～6代HUVECs 隨機分為對照組、5%CSE組、不同濃度辛伐他汀組及辛伐他汀干預組，辛伐他汀組分別加入50、100、200 μmol/L辛伐他汀液孵育24 h，辛伐他汀干預組先以50、100、200 μmol/L辛伐他汀預處理細胞2 h，再與5%CSE孵育24 h。收集各組細胞及上清液，ELISA法檢測上清液中sEPCR蛋白含量，實時定量PCR法檢測各組細胞中mEPCR mRNA的表達。結果(1)5%CSE組sEPCR蛋白含量高于對照組，mEPCR mRNA表達低于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)；(2)100 μmol/L與200 μmol/L辛伐他汀組sEPCR蛋白含量均高于對照組，低于5%CSE組，其mEPCR mRNA表達均低于對照組，高于5%CSE組，差異均有統計學意義(均P<0.05)；(3)各辛伐他汀干預組sEPCR蛋白含量均低于5%CSE組，但高于對照組及相應濃度的辛伐他汀組；相反，各辛伐他汀干預組mEPCR mRNA表達均高于5%CSE組，低于對照組及相應濃度的辛伐他汀組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。結論在體外，辛伐他汀通過上調HUVECs mEPCR mRNA的表達，降低sEPCR的分泌，對CSE介導的內皮細胞凝血功能障礙可能具有一定的改善作用。

香煙煙霧提取物； 內皮細胞蛋白C受體； 人臍靜脈內皮細胞

近年來，內皮細胞蛋白C受體(endothelial cell protein C receptor，EPCR)與血栓形成的關系引起學術界的高度重視。當各種因素導致內皮細胞受損時，膜聯EPCR(membrane-associated EPCR，mEPCR)從內皮細胞脫落，致使可溶性EPCR(soluble EPCR，sEPCR)濃度升高，使血栓形成的風險顯著增加。 因此，測定sEPCR成為反映血栓形成的敏感指標之一[1]。辛伐他汀除其調脂作用之外，還具有內皮保護、抗凝、抑制血小板聚集與抗炎等作用[2]。本實驗通過觀察不同濃度辛伐他汀對香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)sEPCR蛋白及mEPCR mRNA表達的影響，探討其對CSE介導的HUVECs凝血功能的干預作用。

材 料 和 方 法

1材料

HUVECs株購自上海門諜塔生物科技發展有限公司，為ATCC來源細胞株。RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、HEPES均購自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自杭州四季青公司，青霉素、鏈霉素均購自華北制藥股份有限公司，辛伐他汀為默沙東公司產品。人sEPCR ELISA試劑盒購自上海西唐公司，PCR引物、Trizol RNA提取試劑盒、內參照β-actin引物均由上海生工生物工程公司合成，SYBR Green 購自Roche。

2方法

2.1CSE的制備 參照Nakamura等[3]方法，將2支過濾嘴香煙用一個注射器驅動裝置連續抽吸而燃著，每支煙吸5 min，以-5 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)的負壓持續吸引，產生的煙霧經三通管的另一負壓驅動出口溶于50 mL無血清培養液中制成懸液，用1 mol/L的NaOH調pH至7.4，經0.22 μm微孔濾膜過濾，于30 min之內用于實驗。

2.2辛伐他汀干預藥物的制備 將脂溶性辛伐他汀片4.3259 mg(40 mg/片，默沙東中國有限公司，相對分子質量432.59)溶于100 μL無水乙醇，加入150 μL NaOH(1 mol/L)50 ℃溫育2 h，用0.1mol/L HCl調pH至7.2，加雙蒸水至10 mL，即制得終濃度為1 mmol/L的儲存液。經0.22 μm微孔濾器過濾，4 ℃保存，備用。

2.3HUVECs的培養與分組 用含10%FBS的RPMI-1640培養液，在37 ℃、5%CO2培養箱中孵育細胞，隔日換液1次，當細胞生長至亞融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化液以1∶2傳代，接種于25 cm2培養瓶中，待細胞達80%融合后，換無血清培養基繼續孵育24 h，使細胞同步化。貼壁細胞隨機分為8組：(1)CSE組：培養瓶中加入150 μL的CSE，加RPMI-1640培養液至3 mL，使其終濃度為5%CSE；(2)對照組(陰性對照)：培養液中加入與CSE組相同體積的無菌PBS液；(3)辛伐他汀組(陽性對照)：培養液中分別加入50、100、200 μmol/L 辛伐他汀液；(4)辛伐他汀干預組：先分別于培養液中加入50、 100、 200 μmol/L辛伐他汀預孵育2 h，再加入5% CSE孵育。以上各組共同培養24 h，分別收集細胞及上清液用于實驗。

2.4酶聯免疫吸附雙抗體夾心分析法(enzyme linked-immunosorbent assay，ELISA)檢測sEPCR的含量 實驗操作嚴格按試劑盒說明步驟進行。sEPCR標準品濃度分別為4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5 ng/L。

2.5Real-time RT-PCR檢測mEPCR mRNA的表達 按Trizol試劑盒說明提取細胞總RNA。取6 μL的總RNA按轉錄試劑盒說明逆轉錄為相應的cDNA，PCR擴增mEPCR和β-actin(作為內參照)。mEPCR上游引物5’-GGTGTGGCTGTAGGCATCTT-3’，下游引物5’-CTCCCCTCCCTCAAATCTTC-3’。β-actin上游引物5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’，下游引物5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。反應體系為10×buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，正反向引物各0.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，SYBR Green 25 μL，DEPC-H2O 19.0 μL混勻。PCR反應條件為：94 ℃預變性180 s，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共反應35個循環。ABI Prism 7300SDS軟件記錄數據并分析，將目的基因的Ct用β-actin的Ct值進行標準化，根據比較法計算基因表達相對量，采用2-ΔΔCt計算基因表達的相對倍數變化。

3統計學處理

結 果

1HUVECs形態觀察

倒置相差顯微鏡下HUVECs可見細胞由均勻懸浮狀態逐漸貼壁，細胞形態不規則，呈扁平、橢圓形、梭形或多角形，為單層鵝卵石鑲嵌樣排列，細胞單層融合時呈典型的“鋪路石”樣外觀。

25%CSE對HUVECs表達sEPCR蛋白與mEPCRmRNA的影響

對照組HUVECs可表達一定量的mEPCR mRNA，上清液中存在少量sEPCR，5%CSE干預后其mEPCR mRNA表達明顯減少，sEPCR蛋白含量增多，各組比較見表1。

3辛伐他汀對HUVECs表達sEPCR蛋白與mEPCRmRNA的影響

一定濃度的辛伐他汀可影響HUVECs表達sEPCR蛋白與mEPCR mRNA，其與對照組及5%CSE組的比較結果見表1。兩兩比較提示， 50 μmol/L辛伐他汀組mEPCR mRNA表達與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)；100、200 μmol/L辛伐他汀組mEPCR mRNA表達高于對照組，差異有統計學意義，200 μmol/L辛伐他汀組mEPCR mRNA表達高于100 μmol/L辛伐他汀組，差異有統計學意義(均P<0.05)。各辛伐他汀組mEPCR mRNA表達均高于5%CSE組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。sEPCR蛋白表達與mEPCR mRNA呈相反變化。

表1各組HUVECssEPCR蛋白和mEPCRmRNA含量的比較

GroupsEPCRprotein(ng/L)mEPCRmRNAControl1071.197±54.3031.185±0.0725%CSE2239.153±52.271*0.206±0.073*50μmol/Lsimvastatin1133.247±39.412△1.061±0.048*△100μmol/Lsimvastatin1243.353±52.308*△0.956±0.011*△200μmol/Lsimvastatin1355.143±48.820*△0.861±0.052*△5%CSE+50μmol/Lsimvastatin1825.540±116.535*△0.484±0.029*△5%CSE+100μmol/Lsimvastatin1377.197±51.083*△#0.718±0.037*△#5%CSE+200μmol/Lsimvastatin1553.810±46.911*△#0.843±0.026*△#

*P<0.05vscontrol；△P<0.05vs5%CSE；#P<0.05vs5%CSE+50 μmol/L simvastatin.

4辛伐他汀對CSE介導HUVECs表達sEPCR蛋白與mEPCRmRNA的干預作用

各濃度辛伐他汀干預組sEPCR蛋白含量均低于5%CSE組，但仍高于對照組及相對應濃度的辛伐他汀組；相反，各濃度辛伐他汀干預組mEPCR mRNA表達均高于5%CSE組，但仍低于對照組及相對應濃度的辛伐他汀組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。辛伐他汀對CSE介導HUVECs 表達mEPCR mRNA的干預作用在一定范圍內呈濃度依賴性。而對其表達sEPCR蛋白的干預作用雖在一定范圍內呈濃度依賴性，但以100 μmol/L辛伐他汀干預組作用最明顯，見表1。

討 論

蛋白C(protein C,PC)是在抗凝過程中發揮重要作用的一種維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶原[4]。在凝血酶-血栓調節蛋白復合物激活下，蛋白C轉化為活化蛋白C(activated protein C,APC)，與輔因子蛋白S結合，從而滅活凝血因子Va和VIIIa，發揮抗凝作用[5]。EPCR是最近被發現并獲得成功克隆表達的一個新的內皮細胞受體，是體內蛋白C系統發現的新成員[6]。EPCR有mEPCR和sEPCR兩種存在形式，mEPCR無直接抗凝活性，通過與蛋白C結合并將其呈遞給凝血酶-血栓調節蛋白復合物，增加PC/APC的活性，從而提高PC的活化率[7]。sEPCR具有抑制PC/APC活性的作用[8]，通過抑制PC的活化，抑制APC對凝血因子Va和VIIIa的滅活作用[8]。sEPCR與mEPCR是一對在凝血過程中作用相反的物質，血漿中sEPCR升高或mEPCR減少均可導致抗凝機制受抑。

我們曾對CSE介導HUVECs纖溶活性的變化及其作用機制進行研究[9-10]，發現5%CSE具有纖溶抑制作用。CSE是否對內皮細胞的凝血功能也有影響，目前報道不多。因EPCR表達具有組織特異性，在胎盤、肺、肝和心肌組織呈高表達[11]，故本實驗選用HUVECs作為細胞模型，研究CSE對內皮細胞sEPCR與mEPCR表達的影響。結果表明，CSE干預HUVECs后， 其mEPCR mRNA表達降低， sEPCR蛋白分泌增高，提示CSE可引起內皮細胞凝血功能障礙。與Menschikowski等[12]研究結果一致。

目前認為，辛伐他汀除其調脂作用之外，還具有內皮保護、抗凝、抑制血小板聚集與抗炎等作用。辛伐他汀是否可以改善CSE介導的內皮細胞凝血功能障礙，尚未見報道。本實驗結果顯示，辛伐他汀干預組內皮細胞mEPCR mRNA的表達較5%CSE組升高，而sEPCR的含量則降低，提示辛伐他汀可能從基因與蛋白水平影響CSE介導的內皮細胞凝血功能。

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Effectsofsimvastatinoncigarettesmokeextract-inducedsEPCRandEPCRexpressioninhumanumbilicalveinendothelialcells

FAN Fang-fang, HU Xiao-yun, HU Li-juan, HAN Bao-fen, ZHAO Ying-juan

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,ShanxiMedicineUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:huxiaoyunly@sina.com)

AIM: To investigate the effects of simvastatin on cigarette smoke extract (CSE)-induced expression levels of soluble endothelial cell protein C receptor (sEPCR) and membrane-associated endothelial cell protein C receptor (mEPCR ) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSCultured HUVECs at passage 4 to 6 were randomly divided into control group, 5% CSE group, simvastatin groups and simvastatin+CSE groups. In simvastatin groups, HUVECs were incubated with simvastatin at the concentrations of 50, 100 and 200 μmol/L for 24 h. In simvastatin+CSE groups, the cells were treated with simvastatin at the concentrations of 50, 100 and 200 μmol/L for 2 h, and then exposed to CSE for 24 h. The protein level of sEPCR in the culture supernatants was measured by ELISA. The cells were collected for determining the mRNA expression of mEPCR by real-time PCR.RESULTSCompared with control group, the protein level of sEPCR was significantly increased, and the mRNA expression of mEPCR was significantly decreased in 5% CSE group (bothP<0.05) . The protein levels of sEPCR were significantly increased, and the mRNA expression of mEPCR was significantly decreased in 100 μmol/L and 200 μmol/L simvastatin groups. However, the protein levels of sEPCR were lower, and the mRNA expression of mEPCR was significantly higher in 100 μmol/L and 200 μmol/L simvastatin groups than those in 5% CSE group. Compared with 5% CSE group, the protein levels of sEPCR in simvastatin+CSE groups were significantly decreased, but higher than those in control group and simvastatin group with corresponding concentration. On the contrary, the mRNA expression of mEPCR in simvastatin+CSE groups was significantly increased, but lower than that in control group and simvastatin group with corresponding concentration (allP<0.05).CONCLUSIONSimvastatin obviously increases the mRNA expression of mEPCR, decreases the protein level of sEPCR, and attenuates the CSE-induced endothelial injuryinvitro.

Cigarette smoke extract; Endothelial cell protein C receptor; Human umbilical vein endothelial cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.026