大鼠自體原位肝移植模型中腸道羥自由基、丙二醛和總抗氧化能力的變化*

葛 緬, 池信錦, 劉德昭, 蔡 珺, 黑子清

(中山大學附屬第三醫院麻醉科, 廣東 廣州 510630)

1000-4718(2012)04-0723-04

2011-10-27

2012-02-09

國家自然科學基金資助項目(No. 30801080；No. 30972858)

△通訊作者 Tel：020-85252297； E-mail：heiziqing@sina.com

大鼠自體原位肝移植模型中腸道羥自由基、丙二醛和總抗氧化能力的變化*

葛 緬, 池信錦, 劉德昭, 蔡 珺, 黑子清△

(中山大學附屬第三醫院麻醉科, 廣東 廣州 510630)

目的建立SD大鼠自體原位肝移植模型，觀察自體模擬肝移植后不同時期腸道黏膜病理學變化及腸組織的羥自由基(·OH)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)的變化。方法SD大鼠36只，隨機分為假手術組(S組)和模型組(M組)，模型組根據肝臟再灌注時間，再分為再灌注2 h模型組(M1組)、再灌注4 h模型組(M2組)、再灌注8 h模型組(M3組)、再灌注16 h模型組(M4組)和再灌注24 h模型組(M5組)5個亞組。對照組在麻醉后只進行開腹和血管的分離，不進行肝臟的阻斷和灌注；模型組則進行自體肝移植手術。分別在肝臟再灌注后2、4、8、16、24 h取腸組織，觀察其病理形態學變化及·OH、MDA和T-AOC的變化。結果(1)與S組相比，M組大鼠腸黏膜在肝臟再灌注后出現明顯的病理學損傷，可見上皮下間隙的擴大，甚至出現絨毛上皮和固有層分離，再灌注8 h時最為顯著，再灌注24 h開始修復；(2)與S組相比，M2、M3和M4組·OH水平明顯升高(P<0.05)，M1、M2、M3組MDA含量明顯升高(P<0.05)，M1、M2、M3和M4組T-AOC明顯降低(P<0.05)。結論自體原位肝移植可使大鼠腸黏膜·OH和MDA含量增加，T-AOC下降，腸道出現可逆性病理損傷。

肝移植； 缺血再灌注損傷； 羥自由基； 丙二醛； 總抗氧化能力

肝移植手術圍術期由于血流動力學的急劇變化以及門靜脈淤血等因素均可能導致胃腸黏膜缺血缺氧損傷。黑子清等[1]在模擬肝移植術中阻斷豬門靜脈和下腔靜脈的實驗中發現，門靜脈和下腔靜脈阻斷后腸黏膜出現程度不一的病理學損害，證實肝移植中存在腸缺血再灌注損傷。目前國內外關于肝移植動物早期腸道損傷的報道極少，大多研究的是術后某個時點的改變[2-3]。腸缺血再灌注損傷是一個不斷發展的過程，了解不同時期腸道損傷的特點對我們在不同時期采取不同手段進行干預有指導價值。本研究將通過復制SD大鼠自體原位肝移植模型，觀察肝臟再灌注后不同時期腸道黏膜病理學變化及羥自由基(hydroxyl radical，·OH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)的變化規律。

材 料 和 方 法

1儀器和試劑

LD4-2型低速離心機(北京醫用離心機廠)，漩渦混勻器(江蘇金壇市醫療儀器廠)，DKB-600型電熱恒溫水浴箱(上海儀恒實驗儀器有限公司)，Model-680酶聯儀和分光光度計均購自Bio-Rad。BCA法蛋白含量檢測試劑盒、·OH 、MDA和T-AOC試劑盒均為南京凱基生物科技發展有限公司。

2動物與分組

健康SPF 級SD 雄性大鼠36 只，重220～280 g，購自廣東省實驗動物中心。隨機均分為假手術組(S組，n=6)和模型組(M組)，模型組根據肝臟再灌注時間不同再分為5個亞組：再灌注2 h模型組(M1組，n=6)、再灌注4 h模型組(M2組，n=6)、再灌注8 h模型組(M3組，n=6)、再灌注16 h模型組(M4組，n=6)和再灌注24 h模型組(M5組，n=6)。對照組在麻醉后只進行開腹和血管的分離，不進行肝臟的阻斷和灌注。模型組則進行自體肝移植手術，分別在肝臟再灌注后2、4、8、16、24 h時取材。

3自體原位肝移植動物模型的建立[4-5]

大鼠常規禁食12 h, 自由飲水。給予乙醚吸入麻醉后,將大鼠固定在自制的手術臺上。 腹部備皮、消毒，采用腹部正中切口入腹，暴露胸骨柄及劍突后，使用自制拉鉤拉開腹壁。進入腹腔后逆時針方向游離肝臟，先切斷左三角韌帶，結扎、切斷左膈靜脈。然后向左翻轉肝臟，并使用大小合適的濕紗布保護肝臟。進一步打開右側后腹膜，在下腔靜脈深面游離肝裸區，解剖出肝上下腔靜脈。游離出右腎上腺靜脈，給予結扎。在恢復肝臟解剖位置后進一步游離肝下下腔靜脈。暴露第一肝門后，剪開肝十二指腸韌帶，從脾靜脈和腸系膜下靜脈匯合處向上游離門靜脈到肝門部，并將門靜脈壁鞘膜分離干凈。因為肝動脈和膽管關系緊密，將兩者一起進行游離。在進行阻斷前，經尾靜脈注射肝素生理鹽水1 mL，然后在肝動脈、脾靜脈和腸系膜上靜脈匯合處夾上微血管夾，使用4 號針頭刺入門靜脈，然后推注肝素鹽水(25 kU/L) 3 mL，從而使肝內血液進入體循環，固定針頭。開始冷灌注前，分別在肝上下腔靜脈和肝下下腔靜脈夾上微血管夾；并且在肝下下腔靜脈血管夾稍上方靜脈壁剪開大約1 mm 作為灌注液的流出道。使用靜脈輸液泵以2 mL/min 的速度經門靜脈穿刺處緩慢持續灌注0～4 ℃肝素醋酸林格氏液(12.5 kU/L)20 mL，灌注的同時給予冰生理鹽水澆注肝臟表面以降溫，當肝臟顏色全部變為土黃色表示灌注完成。在灌注完畢后拔出穿刺針，分別使用9-0 Prolene線及8-0 Prolene 線修補門靜脈穿刺點和肝下下腔靜脈流出道，在檢查確認修補成功后，分別松開各處微血管夾，結束無肝期(20 min±1 min)，同時給予溫熱生理鹽水澆注肝臟進行快速復溫。仔細止血后，腹腔內使用慶大霉素(8×105U/L)生理鹽水1 mL，最后行連續全層縫合腹壁切口。使用臺燈照射至大鼠蘇醒，自由飲水。

4腸組織病理檢查方法及評分標準

肝臟再灌注后，于各個時點在距離回腸末端5 cm處取0.5～1 cm小腸，用40 g/L多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片(片厚3 μm)，HE染色，用于小腸黏膜光鏡病理觀察。腸黏膜病理變化采用Chiu’s評分法[6]進行評分，0 分：正常黏膜絨毛結構；1 分：上皮下間隙增大，通常在絨毛的尖端，常伴隨有毛細血管淤血；2分：上皮下間隙擴張伴隨上皮層同固有層的中度分離；3 分：絨毛兩側上皮層大量地同固有層分離，部分絨毛頂端破損；4 分：絨毛破損伴隨固有層毛細血管暴露，可能觀察到固有層的細胞成分增多；5 分：固有層破壞和不完整，出血和潰瘍。

5腸組織勻漿和蛋白濃度測定

距回腸末端5 cm開始取大鼠約5 cm小腸，予生理鹽水沖洗腸腔，濾紙吸干后置于-80 ℃冰箱中儲存。檢測前將大鼠小腸標本由-80 ℃冰箱中取出置于冰上，解融后予冰冷的生理鹽水沖洗腸腔，以濾紙吸干后取小腸組織約150 mg，制作小腸組織勻漿。以BCA法測定組織總蛋白濃度。

6腸組織·OH、MDA和T-AOC的測定

檢測使用南京凱基生物科技發展有限公司的試劑盒，具體操作按說明書要求進行。

7統計學處理

結 果

1一般資料

各組之間SD大鼠的質量以及模型組各亞組之間的無肝期長短相似(P>0.05)，見表1。

表1SD大鼠體重、無肝期時間和小腸組織Chiu’s評分變化

GroupWeight(g)Anhepaticphase(min)Chiu’sscoreS238.13±10.32-0.33±0.52M1229.36±11.0919.60±0.660.67±0.52△◇☆M2217.25±15.9919.88±0.641.33±0.52★△◇M3235.65±12.5820.00±0.342.50±0.84★▲#☆M4233.23±17.2320.13±0.452.33±0.82★▲#☆M5229.79±14.6820.13±0.641.50±0.55★▲△◇

★P<0.05vsS group;▲P<0.05vsM1 group;#P<0.05vsM2 group;△P<0.05vsM3 group;◇P<0.05vsM4 group;☆P<0.05vsM5 group. S:sham; M1:2 h after reperfusion; M2:4 h after reperfusion; M3: 8 h after reperfusion; M4: 16 h after reperfusion; M5: 24 h after reperfusion.

2腸黏膜光鏡病理變化

S組大多數黏膜上皮細胞結構完整，排列整齊；少部分出現組織稍充血水腫，未見壞死，見圖1 S。M1組多表現為上皮下間隙的擴大，部分黏膜上皮細胞結構完整，排列整齊，見圖1 M1。M2組1/3表現為絨毛結構破壞，絨毛上皮和固有層的中度分離，2/3僅表現為上皮下間隙的擴大，見圖1 M2；M5組兩種表現各占50%，見圖1 M5。M3和M4組大多出現絨毛兩側上皮層大量地同固有層分離，部分絨毛頂端破損；少部分僅表現為絨毛上皮和固有層的中度分離，見圖1 M3和M4。Chiu’s小腸組織損傷評分中S組最低，M3組最高，兩者評分有顯著差異(P<0.01)；與S組及M1組相比， M3、M4組的Chiu’s評分均明顯增高(P<0.05)，見表1。

3腸組織·OH水平變化

與S組相比，M2、M3和M4組的小腸組織·OH水平明顯升高(P<0.05)；分別與M1、 M5組相比，M2、M3和M4組的·OH水平均明顯升高(P<0.05)，其中M3組·OH水平比M4組升高更為明顯(P<0.05)；而M2和M3組之間無明顯差異(P>0.05)；S、M1和M5組之間無明顯差異(P>0.05),見表2。

Figure 1. Histological analysis of small intestinal mucosa after HE staining (×100). S: sham operation group; M1:2 h after reperfusion; M2:4 h after reperfusion; M3:8 h after reperfusion; M4:16 h after reperfusion; M5:24 h after reperfusion.

圖1各組腸黏膜變化

表2各組SD大鼠小腸組織·OH、MDA和T-AOC的變化

Group·OH(103U/gprotein)MDA(μmol/gprotein)T-AOC(103U/gprotein)S177.50±18.431.51±0.192.00±0.41M1188.90±20.02#△◇2.73±1.04★#1.36±0.23★☆M2377.82±56.76★▲◇☆5.12±1.06★▲△◇☆1.23±0.25★☆M3410.31±76.77★▲◇☆3.30±0.73★#1.21±0.26★◇☆M4298.41±20.20★▲#△☆2.34±0.87#1.56±0.14★△M5187.77±54.33#△◇2.53±1.00#1.74±0.29▲#△

★P<0.05vsS group;▲P<0.05vsM1 group;#P<0.05vsM2 group;△P<0.05vsM3 group;◇P<0.05vsM4 group;☆P<0.05vsM5 group.

4腸組織MDA含量變化

與S組相比，M1、M2和M3組的小腸組織MDA含量明顯升高(P<0.05)，其中M2組較模型組各組升高更明顯(P<0.05)；其余各組之間比較無明顯差異(P>0.05),見表2。

5腸組織T-AOC變化

同時與S組相比，M1、M2、 M3和M4組的小腸組織T-AOC明顯降低(P<0.05)；M3組比M4、M5組小腸組織T-AOC明顯降低；M4和M5組T-AOC逐漸恢復；與M1、M2和M3組相比，M5組的小腸組織T-AOC明顯升高(P<0.05),見表2。

討 論

小腸絨毛的微動脈、微靜脈和毛細血管在腸絨毛的頂端呈弓形的發夾狀，同時它們之間還存在著氧的短路交換和距母支較遠等特點，常導致絨毛頂部供血供氧較差，在缺血缺氧時更易引起損傷[7-8]。無肝前期的出血、低血壓，無肝期門靜脈和腔靜脈阻斷、回心血量驟減，以及新肝期的出血、心功能抑制等均會導致循環波動，反射性交感神經興奮，腸道血流顯著減少，繼發性腸道缺血等。特別在無肝期由于阻斷肝門部血流導致門脈系統所屬靜脈回流受阻，廣泛的腸系膜靜脈淤血，從而減慢小腸壁血流，導致腸黏膜發生淤血性缺血缺氧[9-10]。因此，肝移植過程存在引起腸缺血/再灌注的因素。

目前國內外關于肝移植術后早期腸道損傷研究觀察的多數是術后某個時點的改變。Chen等[2]研究表明，行原位肝移植的大鼠術后24 h小腸的運動功能、屏障功能及吸收功能均明顯降低，認為該變化可能與小腸組織誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)表達增強及血漿內毒素水平增高相關。但是肝移植圍術期腸道損傷是一個漸進的發展過程，動態觀察肝移植術后各時點腸道病理學更能準確反映腸道損傷規律；對此，我們觀察了肝移植不同時點，根據病理評分判斷損傷程度，本研究結果發現自體原位肝移植大鼠腸道在肝臟再灌注后2 h就出現病理學損傷，此時損傷較輕，在再灌注4 h開始損傷逐漸嚴重，在肝臟再灌注8 h時病理評分最高，損傷最嚴重；再灌注16 h和24 h病理評分逐漸降低，雖仍存在較明顯的病理學改變，但較前面時點腸道病理學損傷明顯減輕；研究結果說明正常大鼠肝臟移植術后不同時點腸道損傷表現為早期損傷加重和后期逐漸恢復的特點，表明腸道有較強的自我修復能力。

目前的研究證明[11]，氧化應激引發的自由基損傷是造成缺血再灌注損傷的重要機制之一。缺血再灌注產生大量的氧自由基，·OH是其中重要的氧自由基，檢測·OH可以反映氧自由基的生成情況。Niwa等[12]研究表明機體具有較強的抗氧化損傷能力，這種能力來自于體內的抗氧化防御系統，包括抗氧化酶和抗氧化物質;而自由基的增多可以使機體T-AOC降低，T-AOC不僅可以精確地反映機體的抗氧化狀態，還可以間接評價氧自由基的活性。MDA是不飽和脂肪酸過氧化分解的終產物，其含量的高低不僅可以直接反映體內脂質過氧化的強度和速率，還可以間接反應組織或細胞損傷的嚴重程度，常被作為判斷缺血-再灌注損傷的重要依據。宇汝勝等[13]研究發現大鼠行肝移植術后1 h小腸組織MDA明顯升高，證實缺血再灌注損傷、氧自由基與移植后胃腸動力損害可能密切相關。而本實驗中在肝臟再灌注后4 h、8 h腸道MDA含量、·OH水平明顯升高，其中·OH的增高更持續到術后16h，然后開始逐漸恢復；在肝臟再灌注后2 h腸道T-AOC開始出現明顯下降，到再灌注后8h下降最為嚴重；這些改變與光鏡觀察到的腸黏膜損傷程度結果一致，證明了肝移植術后腸道損傷與脂質過氧化密切相關。

綜上所述，SD大鼠經歷自體原位肝移植會引起腸道損傷，該損傷呈現可逆性特點，其改變可能與腸道自由基增多和抗氧化能力下降有關，但其損傷的具體機制有待進一步研究。

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Changesofhydroxylradical,malondialdehydeandtotalantioxidantcapa-cityinintestinesafterorthotopicliverautotransplantationinrats

GE Mian, CHI Xin-jin,LIU De-zhao, CAI Jun, HEI Zi-qing

(DepartmentofAnesthesiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:heiziqing@sina.com)

AIM: To explore the pathological changes of small intestines after orthotopic liver autotransplantation in rats and to analyze the correlation between these changes and the levels of hydroxy radical (·OH),malondialdehyde(MDA)and total antioxidant capacity(T-AOC).METHODSThirty-six Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group (group S,n=6) and model group (group M). According to the period after liver reperfusion, the rats in group M were divided into 5 sub-groups: 2 h after reperfusion (group M1,n=6), 4 h after reperfusion (group M2,n=6), 8 h after reperfusion (group M3,n=6), 16 h after reperfusion (group M4,n=6), and 24 h after reperfusion (group M5,n=6). After anesthesia, the rats in group S involved laparotomy and vascular dissection without hepatic vascular exclusion and perfusion. The rats in other groups

orthotopic liver autotransplantation. The intestinal tissues starting from 5 cm to terminal ileum were removed 2 h, 4 h, 8 h, 16 h and 24 h after reperfusion. The morphological changes of intestinal epithelial basement membrane were observed under optical microscope. The levels of ·OH, MDA and T-AOC were detected.RESULTS(1) In model groups, the morphological damages in the intestines were significant compared to group S, especially 8 h after reperfusion. The intestines showed massive epithelial lifting down the sides of villi and a few tips being denuded. The repair of pathological damage in the intestines 24 h after reperfusion was observed. (2) Compared to group S, the levels of ·OH in the intestines significantly increased in group M2, M3 and M4 (P<0.05). The levels of MDA in the intestines significantly increased in group M1, M2 and M3 (P<0.05). The levels of T-AOC significantly decreased in group M1, M2, M3 and M4 (P<0.05).CONCLUSIONOrthotopic liver autotransplantation increases the levels of ·OH and MDA, diminishes T-AOC and induces reversible pathological changes in intestines.

Liver transplantation; Ischemia-reperfusion injury; Hydroxyl radical; Malondialdehyde; Total antioxidant capacity

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.025