牙周膜干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

鄭 偉 劉朋飛 馮業(yè)童 董 超 周余來 (通化市口腔醫(yī)院，吉林 通化 34000)

牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cell，PDLSC)是來源于牙周膜的一類成體干細(xì)胞，具有較強(qiáng)的自我更新能力，并且可以進(jìn)一步分化成為多種具有不同功能特性的細(xì)胞。目前研究表明，牙周組織疾病在中老年人中具有較高的發(fā)生率，PDLSC在維持牙周膜功能穩(wěn)定、修復(fù)牙源組織損傷和實(shí)現(xiàn)功能性細(xì)胞更新等方面具有重要意義，該類成體干細(xì)胞是牙周組織再生最為直接可靠的一類種子細(xì)胞，也是牙周組織疾病細(xì)胞治療和基因治療模式最為重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，在組織工程與再生醫(yī)學(xué)中有著重要的應(yīng)用前景〔1，2〕。

1 PDLSC的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)分離鑒定

在2004年，Seo等〔3〕首次從人類牙周膜組織中分離出了一類具有一定分化潛能和較高自我更新能力的成體干細(xì)胞，即PDLSC。研究人員從25組人類第三磨牙中分離牙周膜，經(jīng)過單克隆篩選和相關(guān)基因?qū)W、免疫學(xué)鑒定，獲得了性質(zhì)均一穩(wěn)定的成體干細(xì)胞克隆株，將細(xì)胞移植到免疫缺陷的大鼠和小鼠體內(nèi)，驗(yàn)證細(xì)胞的組織再生和對(duì)牙周病的修復(fù)功能，結(jié)果顯示:PDLSC可向成牙骨質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、膠原形成細(xì)胞等方向分化，并且具有發(fā)育為牙骨質(zhì)-牙周膜樣結(jié)構(gòu)的潛能，在牙周組織修復(fù)方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。

PDLSC有多種分離方式，分離鑒定技術(shù)也較為成熟。Liu等〔4〕采用牙周膜組織塊貼壁培養(yǎng)的方式分離PDLSC，在組織塊貼壁3～6 d后可見有細(xì)胞爬出，7～14 d后細(xì)胞密集生長，間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD146和STRO-1均呈陽性。Chang等〔5〕應(yīng)用膠原酶消化法分離犬類的PDLSC，于37℃條件下，用濃度為0.25%的I型膠原酶對(duì)牙周膜進(jìn)行消化，一段時(shí)間后即可獲得單細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)2 h后即可見貼壁細(xì)胞。該方法的細(xì)胞分離速度明顯快于組織塊貼壁法，但是酶消化時(shí)間不易控制，消化過度常會(huì)影響細(xì)胞活性。Shen等〔6〕結(jié)合上述兩種方法，先將牙周膜組織修剪為1 mm3大小的組織塊，再用I型膠原酶消化40 min后，進(jìn)行組織塊貼壁培養(yǎng)，一段時(shí)間后可見細(xì)胞爬出。該方法所獲得的細(xì)胞自身活性較強(qiáng)，克隆形成效率較高，細(xì)胞在成脂、成骨分化方面具備一定的潛能。

2 PDLSC的分化潛能

PDLSC作為一種成體干細(xì)胞，具備多向分化的潛能，在Seo等〔3〕的實(shí)驗(yàn)中，研究人員將PDLSC移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)，細(xì)胞可進(jìn)一步分化成為牙本質(zhì)-牙周膜樣結(jié)構(gòu)，所以，PDLSC在牙源組織缺損修復(fù)等方面具有重要的應(yīng)用前景。此外，PDLSC在成骨分化及神經(jīng)分化等方面同樣具備一定的分化潛能。

2.1 PDLSC的成骨分化 PDLSC的成骨分化研究較早，Sununliganon等〔7〕通過篩選獲得了具有不同成骨能力的PDLSC克隆株，通過基因微陣列分析研究人員發(fā)現(xiàn):PDLSC的成骨分化能力與細(xì)胞中細(xì)胞間黏附因子、整聯(lián)蛋白β1及端粒末端轉(zhuǎn)移酶密切相關(guān)，因此，可根據(jù)以上細(xì)胞分子的表達(dá)來進(jìn)一步篩選具有高度成骨分化能力的克隆株。Kim等〔8〕以成年比格犬為研究對(duì)象，復(fù)制牙槽骨損傷模型，先將PDLSC用熒光進(jìn)行標(biāo)記后，再將該細(xì)胞與羥基磷灰石/β-磷酸三鈣支架材料相復(fù)合，植入損傷部位，經(jīng)過8 w時(shí)間的修復(fù)，受損部位的組織有明顯的改善，由此進(jìn)一步證實(shí)PDLSC在牙源性組織再生和修復(fù)治療方面的重要應(yīng)用價(jià)值。

2.2 PDLSC的神經(jīng)分化 多種成體干細(xì)胞均具有向神經(jīng)方向分化的潛能，特別是在胚胎形成時(shí)期，與神經(jīng)系統(tǒng)同屬于外胚層的細(xì)胞更具優(yōu)勢(shì)。

Zhen等〔9〕對(duì)PDLSC先采用一定的方式進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，隨后用β-巰基乙醇進(jìn)行神經(jīng)樣細(xì)胞的定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6 h后，進(jìn)行相關(guān)蛋白及基因表達(dá)的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示:經(jīng)誘導(dǎo)的PDLSC表達(dá)神經(jīng)微絲蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白以及神經(jīng)元特異性烯醇酶，并且表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組;從形態(tài)學(xué)角度可見，經(jīng)誘導(dǎo)后的PDLSC有一定的神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)。

3 PDLSC的分化調(diào)節(jié)因素

PDLSC的分化受到多種因素的調(diào)節(jié)，許多物理因素、生化因素均會(huì)對(duì)細(xì)胞的分化模式、分化方向產(chǎn)生影響，合理調(diào)控分化因素，便于對(duì)細(xì)胞定向分化的掌控。

維生素是一種維持人體正常生理功能的一類微量有機(jī)物，在維持細(xì)胞活性，延長細(xì)胞壽命等方面有著重要作用。Wei等〔10〕研究表明，在維生素 C的刺激下，PDLSC的I型膠原、整聯(lián)蛋白β1的表達(dá)量均增多，并且干細(xì)胞標(biāo)記Oct4、Sox2、Nanog的表達(dá)上調(diào)，特別是成骨標(biāo)記RUNX2、ALP和OCN的表達(dá)增加，與未經(jīng)維生素C處理的PDLSC相比，這種類型的PDLSC在組織再生方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。Chadipiralla等〔11〕從人的乳牙牙周膜中分離PDLSC，在維甲酸的作用下連續(xù)培養(yǎng)3 w，結(jié)果顯示:PDLSC在骨源性分化方面具有更大的潛能。

趨化因子是一類可吸引細(xì)胞向特異部位移行的小分子化合物，特別是在炎癥反應(yīng)中有著重要作用。Du等〔12〕通過趨化因子SDF-1刺激PDLSC后，發(fā)現(xiàn)PDLSC的增殖速率和細(xì)胞遷移速度明顯加快，細(xì)胞自身活性也明顯提高，I型膠原分泌水平增加，細(xì)胞在牙周組織分化方面具有更大的潛能。

Yang等〔13〕采用特殊的三維培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)PDLSC進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)而從空間微環(huán)境角度改善細(xì)胞生長狀態(tài)，進(jìn)一步模擬體內(nèi)的生理?xiàng)l件，打破常規(guī)培養(yǎng)方式的局限性。結(jié)果表明:三維培養(yǎng)模式的細(xì)胞骨唾液蛋白及成骨素基因表達(dá)均上調(diào)，堿性磷酸酶表達(dá)量增高，細(xì)胞礦化作用加速。將該細(xì)胞移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)，可分化為類似于牙本質(zhì)-牙周膜樣結(jié)構(gòu)，可見，該方法培養(yǎng)的PDLSC在臨床應(yīng)用上更具前景。

4 PDLSC的重編程與再分化

2006 年，Takahashi等〔14〕將4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4，Sox2，cMyc和Klf4)導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞中，獲得了一種類似于胚胎干細(xì)胞狀態(tài)、具有多向分化潛能的細(xì)胞，稱為“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”(induced pluripotent stem cells，iPS cells)。繼此之后，Yu 等〔15〕和Takahashi等〔16〕分別成功地將普通的人體皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為了具備人胚胎干細(xì)胞功能的iPS細(xì)胞，從而進(jìn)一步推動(dòng)了人源iPS細(xì)胞的研究發(fā)展。Kang等〔17〕首次利用iPS細(xì)胞，通過四倍體囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，從而在世界上第一次證明了iPS細(xì)胞的全能性。

一般認(rèn)為，“重編程”是指成體細(xì)胞經(jīng)過一定誘導(dǎo)方式，轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS細(xì)胞的過程;iPS細(xì)胞經(jīng)過進(jìn)一步的定向誘導(dǎo)，再次分化為其他類型細(xì)胞的過程，稱為“再分化”。通過重編程過程，可使成體細(xì)胞，甚至是終末分化細(xì)胞重新具有較高的分化能力，所以，iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)技術(shù)已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Wada等〔18〕通過逆轉(zhuǎn)錄病毒法將 Oct4，Sox2，cMyc和 Klf4四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入PDLSC中，經(jīng)過重編程后，獲得了PDLSC來源的 iPS細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá) SSEA4，OCT4，NANOG，GCTM-2，TG30和TRA-1-60等胚胎干細(xì)胞標(biāo)記，在體外非定向分化的過程中，三胚層的代表基因均發(fā)生不同程度的變化，并且iPS細(xì)胞可在免疫缺陷鼠體內(nèi)形成畸胎瘤，具備向三個(gè)胚層方向分化的潛能。Duan等〔19〕采用iPS與釉基質(zhì)衍生物相復(fù)合的方法在體外誘導(dǎo)iPS定向分化，經(jīng)過一段時(shí)間的誘導(dǎo)，iPS細(xì)胞中多種牙源組織相關(guān)基因均大量表達(dá);組織學(xué)分析顯示，iPS復(fù)合物具有一定向牙槽骨和牙周膜方向分化的趨勢(shì)。

5 展望

隨著再生醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，PDLSC作為一種新發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞已經(jīng)逐漸引起人們的關(guān)注。諸多研究表明，PDLSC是牙周組織工程中的最有潛力的一類種子細(xì)胞，該細(xì)胞的高度自我更新能力和多向分化潛能使其在臨床應(yīng)用上具有廣泛的前景〔20〕。但是，也應(yīng)認(rèn)識(shí)到，關(guān)于PDLSC的諸多研究內(nèi)容尚處于基礎(chǔ)研究階段，在這一階段中還有許多問題需要解決，例如:如何高效獲得大量PDLSC、如何有效控制PDLSC的定向分化等。因此，只有完善PDLSC的一系列基礎(chǔ)研究，建立安全可靠的臨床應(yīng)用模式，PDLSC才能真正為牙周疾病患者提供一條新的治療途徑。

1 Kim BC，Bae H，Kwon IK，et al.Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine〔J〕.Tissue Eng Part B Rev，2012 Mou 6〔Epub ahead of print〕.

2 Wang L，Shen H，Zheng W，et al.Characterization of stem cells from alveolar periodontal ligament〔J〕.Tissue Eng Part A，2011;17(7-8):1015-26.

3 Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament〔J〕.Lancet，2004;364(9429):149-55.

4 Liu J，Zha HY，Xuan DY，et al.Differentiation characteristics of human periodontal liga-ment cell population in vitro〔J〕.Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2010;28(2):185-9.

5 Chang XM，Liu HW，Jin Y，et al.Isolation and identification of dog periodontal ligament stem cells〔J〕.Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2009;27(1):79-83.

6 Shen T，Chang HJ，Jian CX，et al.Isolation and identification of human periodontal ligament stem cells in vitro〔J〕.Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2011;29(1):71-4，78.

7 Sununliganon L，Singhatanadgit WC.Highly osteogenic PDL stem cell clones specifically express elevated levels of ICAM1，ITGB1 and TERT〔J〕.Ytotechnology，2012;64(1):53-63.

8 Kim SH，Kim KH，Seo BM，et al.Alveolar bone regeneration by transplantation of periodontal ligament stem cells and bone marrow stem cells in a canine peri-implant defect model:a pilot study〔J〕.J Periodontol，2009;80(11):1815-23.

9 Zhen L，Liu HW.Differentiation of human periodontal ligament stem cells into neuron-like cells in vitro〔J〕.Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2009;27(1):71-4.

10 Wei FL，Qu CY，Song TL，et al.Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity〔J〕.J Cell Physiol，2011;227(7):21.

11 Chadipiralla K，Yochim JM，Bahuleyan B，et al.Osteogenic differentiation of stem cells derived from human periodontal ligaments and pulp of human exfoliated deciduous teeth〔J〕.Cell Tissue Res，2010;340(2):323-33.

12 Du L，Yang P，Ge S.Stromal cell-derived factor-1 significantly induces proliferation，migration and collagen type I expression in a human periodontal ligament stem cell subpopulation〔J〕.J Periodontol，2012;83(3):379-88.

13 Yang Z，Jin F，Zhang X，et al.Tissue engineering of cementum/periodontal-ligament complex using a novel three-dimensional pellet cultivation system for human periodontal ligament stem cells〔J〕.Tissue Eng Part CMethods，2009;15(4):571-81.

14 Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors〔J〕.Cell，2006;126(4):663-76.

15 Yu SJ，Soncini M，Kaneko Y，et al.Amnion:a potent graft source for cell therapy in stroke〔J〕.Cell Transplant，2009;18(2):111-8.

16 Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors〔J〕.Cell，2007;131(5):861-72.

17 Kang L，Wang J，Zhang Y，et al.iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos〔J〕.Cell Stem Cell，2009;5(2):135-8.

18 Wada N，Menicanin D，Shi S，et al.Immunomodulatory properties of human periodontal ligament stem cells〔J〕.J Cell Physiol，2009;219(3):667-76.

19 Duan X，Tu Q，Zhang J，et al.Application of induced pluripotent stem cells in peridontal tissue regeneration〔J〕.J Cell Physiol，2011;226(1):150-7.

20 Menicanin D，Bartold PM，Zannettino AC，et al.Identification of a common gene expression signature associated with immature clonal mesenchymal cell populations derived from bone marrow and dental tissues〔J〕.Stem Cells Dev，2010;19(10):1501-10.