磷酸二酯酶4D SNP與缺血性腦卒中的相關性

曾憲思 白 潔 (昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650224)

磷酸二酯酶(PDEs)是一個多基因家族。PDEs催化環腺苷酸(cAMP)和環鳥苷酸(cGMP)分別生成AMP和GMP，這是細胞內降解cAMP和cGMP的唯一途徑。PDEs可以分為11個家族，分別為1～11，其中PDE4能特異性地水解cAMP。PDE4又可以分為A、B、C和D 4個亞家族。關于PDE4D基因與缺血性腦卒中相關性的研究結果不一致。本文將就PDE4D和缺血性腦卒中的研究進展做一綜述。

1 PDE4D基因、蛋白結構及其功能

1.1 PDE4D基因 PDEs由20個基因組成，根據氨基酸序列同源性、酶作用底物特異性和藥理學性質將它們分成11個家族。11個PDEs的任一個都包括1～4個不同的基因〔1〕。PDE4有A、B、C、D四個亞家族。PDE4D基因在人類染色體中定位于5q12，大小約為1.6 Mb，包含24 個外顯子〔2〕。

1.2 PDE4D蛋白結構 PDE4D基因通過使用多個啟動子和選擇性拼接編碼若干個功能蛋白亞型，分別為PDE4D1～9。這些蛋白的催化區和C－端是一致的，N－端差異較大。根據N－端是否含有上游保守序列(UCR)可以將它們分成長式結構、短式結構和超短式結構。長式結構包含上游保守序列1和2(UCR1和UCR2)，短式結構缺少UCR1，超短式結構缺少UCR1和部分UCR2。UCR1和UCR2分別含有60和80個氨基酸殘基，它們由連接區1(LR1)連接，LR1長度大約為24個氨基酸殘基，UCR2通過LR2與催化區相連，LR2大小為10～28個氨基酸。在人類中長式結構有PDE4D3～5蛋白和PDE4D7～9，短式結構只有 PDE4D1，超短式結構有 PDE4D2 和 PDE4D6〔1，3〕。

1.3 PDE4D的功能 PDE4在體內廣泛表達，主要分布于各種炎性細胞內，包括肥大細胞、巨噬細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞和上皮細胞等。cAMP和cGMP是細胞內的第二信使，它們在神經傳遞、肌肉收縮、免疫反應、細胞生長和分化、代謝、視覺、嗅覺、記憶、胞吐作用等生理過程中起重要作用。而細胞內cAMP和cGMP的合成和降解都要受到嚴格的調控:腺苷酸環化酶(AC)和鳥苷酸環化酶(GC)分別將ATP和GTP轉變為相應的環化結構形式，而PDEs催化cAMP和cGMP水解，開環，分別生成非活性形式的5′AMP和5′GMP。這是細胞內降解cAMP和cGMP的惟一途徑。在11個PDEs家族中有8個能降解cAMP，PDE4能特異性降解cAMP。有證據表明cAMP信號是區域化的〔4〕。PDE4在不同時間調節cAMP濃度改變，所引起的cAMP介導的信號途徑不同。在正常細胞中PDE4D占PDE4活性的60% ～70%，而在炎癥細胞中 PDE4D至少占PDE4活性的80%。PDE4D對炎癥、血小板穩定性、損傷應答、血管生成的影響不同，在腦卒中發生發展過程中起不同的作用。deCODE研究組和其他的研究者證實，PDE4通過各亞型的相對表達量來調節PDE4D活性。PDE4D在其表達的組織中調節生物活性中扮演著復雜的角色〔5〕。

1.4 PDE4D的短期調節

1.4.1 UCR1和UCR2以及催化區的作用 PDEs的N－端具有調節功能，UCR1和UCR2對PDEs的活性具有重要的調節作用。UCR1疏水的C－端與UCR2親水的N－端相互作用，UCR1/2又與PDE4D催化區相作用，從而調節PDE4D活性。UCR1和UCR2介導cAMP－依賴蛋白激酶(PKA)和細胞外信號調節激酶2(ERK2)磷酸化。PKA可以將UCR1中特定位點的絲氨酸殘基磷酸化，進而提高了長式PDE4D活性。而絲氨酸殘基在整個家族中極其保守，對酶活性的維持起重要作用。PKA磷酸化破壞了處于低活性狀態的離子對及UCR1與UCR2的相互作用，導致其構象改變，激活長式PDE4D。ERK可以將催化區絲氨酸殘基磷酸化，進而導致PDE4D活性降低。這種抑制作用是暫時的:當細胞外的刺激作用于細胞膜后，產生一系列信號。cAMP是信號傳導途徑中的重要信使，當細胞外信號分子(配體)與G蛋白耦聯受體(GPCRs)結合后激活AC，細胞內cAMP水平迅速升高，PKA被激活并將UCR1中的絲氨酸殘基磷酸化，從而消除ERK的抑制作用。短式PDE4D缺少UCR1，卻反而被ERK的磷酸化活化，可能有其他調節成分參與。此外，ERK對超短式PDE4D活性沒有影響〔6〕。

1.4.2 PDE4D信號復合物 PDE4D能和某些蛋白如抑制蛋白(arrestin)結合而定位于細胞特定的區域內。PDE4D及其錨定蛋白在細胞內選擇性地表達來調控cAMP信號。Arrestin是信號支架蛋白，在許多GPCRs脫敏過程中起重要作用。目前已知 arrestin 有4 個成員:β－arrestin1、β－arrestin2 和兩個視覺 arrestin。PDE4D通過它們保守的催化區與β－arrestin形成穩定的信號復合物。β腎上腺素受體(βAR)，βAR有兩種亞型:β1－AR和β2－AR。βAR與胞外信號結合后會產生兩條不同的信號通路:首先都是Gs介導的cAMP信號通路，Gs激活AC隨之產生cAMP。然后PKA使βAR磷酸化，β1－AR與PDE4D8形成信號復合物 β1－AR/PDE4D8，而 β2－AR 要與 β－arrestin 結合后才能與 PDE4D5 形成信號復合物 β2－AR/β－arrestin/PDE4D5〔1〕。另外，在恐懼條件下，β－arrestin－2會轉移到杏仁核胞膜處與PDE4D結合成β－arrestin－2/PDE4D復合物，進而抑制了PKA的活性〔7〕。

2 咯利普蘭

咯利普蘭(roliplam)是1976年鑒定的第一個PDE4抑制劑，也是迄今為止最為常用的經典PDE4抑制劑〔8〕。咯利普蘭是一種選擇性的PDE4抑制劑，能夠特異性抑制PDE4的活性，增加細胞內的cAMP水平，進而激活多種蛋白磷酸化途徑，對中樞神經功能、心血管功能、炎癥細胞/免疫系統、細胞黏附以及代謝過程都有影響。用咯利普蘭的短時(2 min)預處理引起人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)cAMP的上升，然而長時(8 h)預處理會引起HUVEC cAMP的下降。用咯利普蘭長時預處理誘導PDE4活性明顯增加。這一結果表明咯利普蘭對PDE4的抑制能誘導PDE4活性的增加，這可能作為促進cAMP降解的代償機制〔9〕。咯利普蘭是作用于細胞內靶點的新型抗炎藥物，但是PDE3和PDE5的抑制劑的共同處理能降低咯利普蘭的抗炎癥效應〔10〕。咯利普蘭能抑制相關炎癥細胞的招募和激活，抑制由脂多糖(LPS)引起的炎癥因子的產生。咯利普蘭能增加大鼠細胞質胰高血糖素樣肽1(GLP－1)的濃度，并且能夠增強葡萄糖誘導的 GLP－1 的釋放〔11〕。

3 缺血性腦卒中

腦卒中是神經系統常見病和多發病，死亡率約占所有疾病的10%，是世界范圍內的死亡和長期致殘的三大原因之一〔12，13〕。腦卒中是癡呆和年齡相關的認知下降的重要原因，還是晚發癲癇癥的主要原因〔14〕。大約50% ～70%的存活者遺留癱瘓、失語等嚴重殘疾。腦卒中包括缺血性腦卒中、出血性腦卒中、高血壓腦病和血管性癡呆，其中大約80%的腦卒中源于缺血性，大多數由動脈硬化癥引起〔15〕。根據TOAST(the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment)標準，缺血性腦卒中可以再細分成3個主要的種類:(1)大動脈硬化癥，(2)心源性梗死，(3)梗死引起的小脈管閉塞〔12〕。環境和遺傳因素都有能引起缺血性腦卒中的危險，一直以來，糖尿病、高血壓、心肌梗死以及抽煙史等被認為是腦卒中的經典危險因素。然而，這些環境危險因素的控制并沒有降低腦卒中的發病率〔16〕，是由于對這種疾病的易患病的體質的遺傳基礎知之甚少〔17〕。

4 PDE4D與缺血性腦卒中

2003年，冰島的 Gretarsdottir等〔18〕deCODE研究組成員發現，PDE4D基因的多態性增加了缺血性腦卒中的危險性。他們在冰島人群中發現了與家族性缺血性腦血管病(ICVD)相關的基因:PDE4D基因與腦動脈粥樣硬化的發生、發展有關。該基因和以往認識的與高血壓、糖尿病、血脂代謝異常、高膽固醇血癥等腦血管病危險因素的相關基因不同，被認為是21世紀首先、也是迄今唯一新發現的腦卒中候選基因〔12，19〕。他們發現PDE4D 單核苷酸多態性(SNP)89，SNP 87，SNP 83，SNP56，SNP45和SNP41等6個SNPs與缺血性腦卒中危險密切相關。

此后，全球的腦血管病研究學者掀起了研究該基因的熱潮，但是難以達成共識。Staton等〔15〕在對澳大利亞人 PDE4D基因高度保守區進行系統性多態性研究基礎上，對初次缺血性腦卒中患者PDE4D基因的6個SNP進行多態性分析，發現PDE4D SNP 89，SNP 87，SNP 83 及 PDE4D 單模標本89－87－83 與缺血性腦卒中有重大關聯，這和對冰島人的研究結果是一致的。但是沒有證明腦卒中與PDE4D SNP 56、SNP 45或SNP 41存在顯著的關聯。Kostulas等〔17〕對瑞典人的病例－對照研究發現缺血性腦卒中與SNP45關聯不大，但單模標本SNP45－41與缺血性腦卒中密切相關。Kim等〔20〕挑選韓國患者PDE4DSNP41作為候選標記，但是在病例和對照之間PDE4D SNP 41基因型的分布沒有發現重大的不同〔20〕。而 Song等〔2〕對美國人的病例－對照研究結果表明，在基因5′端的一個內含子中發現的SNP rs918592與缺血性腦卒中的相關密切。Munshi等〔21〕對印度250個病人和250個健康人的病例－對照研究表明，SNP83與缺血性腦卒中關聯重大而SNP87關聯不大。對這些顯然相矛盾的結果最可能的解釋是，SNP檢測與缺血性腦卒中不是直接連鎖的，而是與原因等位基因不均一連鎖的，這在不同的人群中不同。此外，Liao等〔22〕對高雄醫科大學附屬醫院2006年1月到2007年11月的腦卒中病人研究表明，PDE4D的遺傳效應在男性中明顯而在女性中不明顯。這些結果表明對PDE4D基因還有待更進一步的研究。

5 展望

缺血性腦卒中是世界范圍內死亡和長期殘疾的三大原因之一，給患者家庭造成了嚴重的經濟和心理負擔。缺血性腦卒中危險環境因素和遺傳因素的研究對其預防和治療起到一定的作用。缺血性腦卒中等位基因PDE4D的發現使缺血性腦卒中的預防與治療進入了一個新紀元。PDE4抑制劑咯利普蘭引入到臨床更是對缺血性腦卒中治療達到了極好的效果。

PDE4D基因SNP的研究結果表明，缺血性腦卒中在不同的人群中的SNP定位是不同的。這就為缺血性腦卒中的預防與治療增加了相當的難度。因此，應進一步研究PDE4D在缺血性腦卒中的過程中的作用分子機制，以及不同的SNP定位的對缺血性腦卒中的影響，為臨床治療提供治療靶點。

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