加味消渴康對(duì)糖尿病腎病大鼠纖維粘連蛋白、層粘連蛋白和Ⅳ型膠原表達(dá)的影響

張 鋮 李鳳婷 李 夢 岳順卿 耿建國* 章九紅

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)教研室，北京100069;2.河南省平頂山市醫(yī)學(xué)會(huì)，平頂山467000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要微血管病變之一，是以腎小球硬化癥為主要病理變化的嚴(yán)重合并癥，也是引起終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要原因之一［1］。研究［2］顯示，纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、層粘連蛋白(laminin，LN)和Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)在腎組織內(nèi)積聚可以導(dǎo)致腎小球硬化，進(jìn)而引起DN發(fā)生。因此，減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚是延緩DN發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法，觀察加味消渴康對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織FN、LN及Ⅳ型膠原表達(dá)的影響，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量160～180 g，鼠齡2～3月齡，購自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部〔動(dòng)物的合格證號(hào)：SCXX(京)2006-0009〕。加味消渴康由生黃芪10 g、山萸肉30 g、生薏仁30 g、水蛭6 g、葛根30 g、丹參10 g、決明子10 g組成，藥材購自北京祥威藥業(yè)公司;氯沙坦購自杭州默沙東制藥有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：09422)。鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司);兔抗FN多克隆抗體(美國abcam公司);兔抗LN多克隆抗體(美國abcam公司);兔抗Ⅳ型膠原多克隆抗體(美國abcam公司)。

1.2 動(dòng)物模型及分組

1)糖尿病腎病動(dòng)物模型的建立：將造模大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，行右側(cè)腎臟切除術(shù)。術(shù)后2周，禁食12 h，按50 mg/kg體質(zhì)量的劑量進(jìn)行單次腹腔內(nèi)注射。72 h后，尾靜脈采血，用sure-step血糖儀測定大鼠血糖，用尿糖試紙測大鼠隨意尿糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L，尿糖定性＞+++，確定DN造模成功。

2)分組及給藥：將成模大鼠用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組6只。正常組(A組)、模型組(B組)、氯沙坦組(C組，給藥量為成人藥量/60 kg×6.25，即5.2 mg/kg)、中藥組(D組，給藥量為成人藥量/60 kg× 6.25，13.125 g·kg－1·d－1)每日1次，連續(xù)灌胃12周，正常組及模型組每日灌服等量蒸餾水。

1.3 標(biāo)本采集和檢測方法

各組大鼠于給藥后第12周末進(jìn)行腎臟取材。腎組織常規(guī)制片，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法測定腎組織FN、LN和Ⅳ型膠原的蛋白表達(dá)，400倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，并用圖文處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 for Windows進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析法和LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 治療后各組大鼠血糖、腎功能比較

血糖方面，模型組及給藥組較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.476，P＜0.01);在腎功能方面，模型組及給藥組血尿素氮較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.767，P＜0.01);模型組、氯沙坦組血肌酐較正常組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =1.676，P＜0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠血糖、腎功能比較Tab.1 Comparison of blood glucose and renal function among four groups of rats

2.2 對(duì)腎組織FN表達(dá)的影響

1)腎組織免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果：正常組腎小管間質(zhì)FN表達(dá)最少(圖1A);模型組腎小管間質(zhì)FN表達(dá)最多(圖1B);氯沙坦組FN表達(dá)少于模型組(圖1C);中藥組FN表達(dá)少于西藥組(圖1D)。

2)積分吸光度比較結(jié)果：與正常組比較，模型組、氯沙坦組、中藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.947，P＜0.01);與模型組比較，氯沙坦組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.947，P＜0.05)，中藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =29.947，P＜0.01);中藥組與西藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，詳見表2。

2.3 對(duì)腎組織LN表達(dá)的影響

1)腎組織免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果：正常組腎小管間質(zhì)LN表達(dá)最少(圖2A);模型組腎小管間質(zhì)LN表達(dá)最多(圖2B);氯沙坦組LN表達(dá)少于模型組(圖 2C);中藥組LN表達(dá)少于西藥組(圖2D)。

2)積分吸光度比較結(jié)果：與正常組比較，模型組、中藥組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.691，P＜0.01);與模型組比較，西藥組、中藥組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.691，P＜0.01)，詳見表3。

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)纖維粘連蛋白積分吸光度比較Tab.2 Comparison of tubulointerstitial fibronectin sumdensity among four groups

表3 各組大鼠腎小管間質(zhì)層粘連蛋白積分吸光度比較Tab.3 Comparison of tubulointerstitial laminin sumdensity among four groups

2.4 對(duì)腎組織Ⅳ型膠原表達(dá)的影響

1)腎組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：正常組腎小管間質(zhì)Ⅳ型膠原表達(dá)最少(圖3A);模型組腎小管間質(zhì)Ⅳ型膠原表達(dá)最多(圖3B);氯沙坦組Ⅳ型膠原表達(dá)少于模型組(圖3C);中藥組Ⅳ型膠原表達(dá)少于西藥組(圖3D)。

圖3 各組大鼠腎小管間質(zhì)Ⅳ型膠原的表達(dá)Fig.3 Tubulointerstitial collagenⅣexpression of each group(400×)A：normal group;B：model group;C：losartan group;D：traditional Chinese medicine group.

2)積分吸光度比較結(jié)果：與正常組比較，模型組、西藥組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.322，P＜0.05，P＜ 0.01);與模型組比較，中藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =5.322，P＜0.05);中藥組與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表4。

表4 各組大鼠腎小管間質(zhì)Ⅳ型膠原積分吸光度比較Tab.4 Comparison of tubulointerstitial collagenⅣsumdensity among four groups

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病的血管合并癥，多隱匿起病，早期不易察覺，而到晚期出現(xiàn)顯性蛋白尿時(shí)，則已經(jīng)錯(cuò)過治療時(shí)機(jī)。因此診斷和治療DN宜早不宜晚，應(yīng)該在腎臟病變處在代償期時(shí)予以干預(yù)，延緩其進(jìn)展到失代償期。其中，中醫(yī)藥治療則是有效方法之一［3］。

根據(jù)糖尿病腎病本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī)，以扶正祛邪為治療法則，應(yīng)用加味消渴康治療糖尿病腎病，在臨床上取得了一定療效。本方由生黃芪、山萸肉、生薏米、葛根、決明子、丹參、水蛭組成，具有健脾益腎，祛瘀化濁的功效。本方在生黃芪、山萸肉等健脾益腎藥物的基礎(chǔ)上加入了水蛭、丹參等活血化瘀藥以及決明子、生薏米等利濕化濁藥，旨在糖尿病腎病早期祛除瘀血，清利濕濁，更加有利于顧護(hù)正氣。研究［4］表明，黃芪可以減輕DN大鼠蛋白尿，改善腎功能，并可抑制腎組織LN的表達(dá)。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能抑制糖尿病大鼠腎皮質(zhì)糖化終產(chǎn)物的形成，使其受體mRNA表達(dá)水平下降，可以減輕DN病變［5］。決明子可以抑制DN大鼠腎組織內(nèi)核因子-кB的活性，進(jìn)而延緩DN的進(jìn)展［6］。丹參能夠保護(hù)DN大鼠腎功能，并抑制腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1和Ⅳ型膠原的表達(dá)［7］。仝小林等［8］研究顯示，水蛭可以改善DM大鼠血液高粘、高凝狀態(tài)，并能降低DM大鼠的尿微量白蛋白。顧江平等［9］研究顯示，水蛭可以降低DN大鼠腎組織內(nèi)皮素-1的表達(dá)，并能降低腎臟指數(shù)(腎質(zhì)量/體質(zhì)量)。李琳等［10］研究顯示，水蛭可以降低DN大鼠血清肌酐、尿素氮水平，并能降低24 h尿微量白蛋白，此外，水蛭還能降低DN大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1的表達(dá)，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，加味消渴康能夠降低DN大鼠腎組織的FN、LN和Ⅳ型膠原的積聚，對(duì)防治糖尿病腎病有一定的作用，其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

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