雄激素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠星形膠質細胞的影響

李 婛， 季 興， 曾 麗， 李 偉， 楊淑青

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統自身免疫性疾病，以分散性脫髓鞘、軸索損傷和炎癥活動為特征［1］。流行病學研究發現，女性患病率高于男性，而且癥狀還和體內雌激素水平變化相關［2，3］。近年來，有研究顯示，雄激素對 MS具有一定的治療作用［3，4］。星形膠質細胞在炎性脫髓鞘疾病中明顯活化，在MS和EAE發生發展中發揮重要作用［5］。本研究采用實驗性自身免疫性脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠模型觀察雄激素對大鼠EAE中樞神經系統星形膠質細胞的影響來探討其中部分作用機制。

1 材料和方法

1．1 試劑 質量分數為20%的烏拉坦，完全弗式佐劑(CFA，Sigma公司提供，含卡介苗5mg/ml)、卡介苗(衛生部上海生物制品研究所)、丙酸睪酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司)、免疫試劑中(原裝進口分裝)已稀釋的即用型膠原纖維酸性蛋白 (glialfibrillary acidic protein，GFAP)Ⅰ 抗(2．5ml)，Ⅱ抗為(原裝進口分裝)生物素化羊抗兔IgG 1 支(濃度 1．5mg/ml，稀釋比為 1∶300 ～1∶500)50μl+抗體稀釋液20ml，鏈霉親和素抗生物素蛋白-過氧化酶免復合物1支(濃度1μmol/L，稀釋比1∶50～1∶200)100μl，DAB 顯色液 5m(均由北京博奧森提供)。

1．2 實驗動物 健康純種遠交雌性Wistar大鼠50只，8～10周齡，體質量180～220g，采取隨機數字表分發，分為生理鹽水對照組(對照組，10只)、EAE模型組(模型組，20只)和丙酸睪酮干預組(雄激素干預組，20只)。成年豚鼠8只，雌雄不限，體質量300～400g。所有動物均由廣西醫科大學動物實驗中心提供，置于恒溫恒濕的環境，分籠飼養，每籠2～3只，自由攝食和飲水。

1．3 實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型制備參考文獻［5］方法，將豚鼠斷頭處死，剪開枕骨及椎管剝離脊髓，去掉馬尾與脊髓膜。稱重，加入等量的生理鹽水，用勻漿機(YQ-3，日本株式社會)制成質量分數為50%的脊髓勻漿(GPSCH)。再與等量的CFA(每毫升含卡介苗5mg)混勻后制成油包水型乳劑，置于4℃冰箱備用。模型組與治療組(雄激素干預組)均在足底真皮下及頸部3點共注射0．5ml GPSCH+CFA。對照組，在足底真皮下及頸部3點共注射0．5ml NS+CFA。

1．4 試驗動物分組及處理 隨機將大鼠分為3組，分別為對照組10只，模型組20只，治療組20只。(1)對照組:生理鹽水加完全弗式佐劑作為免疫原誘導造模后，腹腔注射無菌生理鹽水。(2)模型組:EAE模型建立后，腹腔注射無菌生理鹽水。(3)干預組:EAE模型建立后，腹腔注射丙酸睪酮。以致敏當日為第0天，對照組與模型組于致敏當日腹腔注射無菌生理鹽水，按2ml/kg劑量給予。干預組于致敏當日腹腔注射丙酸睪酮，按2ml/kg劑量給予。

1．5 臨床評分 EAE神經功能缺損評分標準:0分，未發病;1分，動物尾部無力;2分，動物尾部無力+前肢或后肢中等無力;3分，前肢或后肢嚴重無力，將鼠翻倒后不能復位;4分，肢體癱瘓，將鼠翻倒后不能復位;5分，瀕死狀態。其中1～5分為實驗成功模型。規定致敏當日為第0天，并在每日早晚各兩次觀察動物行為學方面的變化，予以詳細記錄，同時每天測一次體重。于21d時全部處死。

1．6 免疫組化方法檢測星形膠質細胞GFAP處死后的模型組與治療組評分在1分及以上已取血的大鼠，正常組在免疫以后21d統一處死，取大腦、腦干和脊髓放在濃度為10%的甲醛中固定，然后包埋，切片，常規HE染色，砂羅硌花青法髓鞘染色，以及免疫組化染色，采取SP法:大腦、腦干和脊髓的石蠟切片，10μm厚，脫蠟后，檸檬酸高壓抗原修復，在加入3%H2O2室溫處理，正常血清封閉后，一次滴加一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜，生物素標記二抗，室溫下孵育15min，辣根酶標記的鏈卵白素室溫下孵育15min，DAB染色，顯微鏡下觀察，顯色2～10min，中性膠封片，各步前均用0．01mol/L PBS(pH 7．2～7．5)沖洗5min×3次。圖像處理:每個動物取3張切片，每個切片隨機取互不重疊的3個視野，采用德國LEICA公司生產的病理分析儀(型號:DMR+Q550)對圖像進行分析，計算大腦、腦干、脊髓各部位GFAP的陽性細胞個數(個/視野)。

2 結果

2．1 建模情況 模型組大鼠平均于免疫后13d開始發病，治療組平均于免疫后17d開始發病，發病表現為活動減少、進食少、精神不振、體重減輕，先出現尾肌力降低，尾巴拖地不能抬起，繼而后肢無力、癱瘓。如表1所示，治療組的發病率40%，模型組的發病率為60%。治療組的潛伏期(20．87±1．13d)，比模型組的潛伏期(18．11 ±1．34d)延長，二者比較差異有顯著性(P＜0．05)。治療組的臨床評分(1．56±0．99 分)比模型組的臨床評分(1．87 ±0．73分)低，但二者比較差異無顯著性(P＞0．05)。這些結果表明處理組的雄激素干預可以延遲發病，降低發病率，但對病情嚴重程度無明顯改善。

表1 3組大鼠的行為學觀察(±s)

表1 3組大鼠的行為學觀察(±s)

組別 動物數 發病數(%) 潛伏期(d)臨床評分(分)正常對照組模型組雄激素干預組10 20 20 0－0 12(60%)8(40%)18．11 ±1．34 20．87 ±1．13 1．87 ±0．73 1．56 ±0．99

2．2 病理學改變 HE染色觀察發現，模型組大鼠在發病后，大腦、腦干和脊髓內可見有大量淋巴細胞浸潤，聚集在小血管周圍呈袖套樣改變;雄激素干預組)仍可見炎癥細胞浸潤，以及“袖套樣”改變，但明顯少于模型組。炎性細胞浸潤以腦干最明顯，其次為脊髓，大腦最少。HE染色發現，發病的大鼠腦和脊髓結構疏松，呈彌漫性脫髓鞘改變。結果表明，干預組大鼠的病理改變與模型組相比較，有不同程度的減輕。而正常對照組未見異常改變。這些結果與上述行為學觀察相一致，表明成功建模，而且雄激素具有明顯干預作用。

2．3 星形膠質細胞的變化 GFAP染色結果顯示，正常對照組大鼠免疫組化染色后可見星形膠質細胞的樹突呈向心排列，細胞數較少，胞體不明顯;模型組大鼠在發病后可見胞體明顯增大，突起增長和增粗，GFAP免疫反應明顯增強;治療組大鼠與正常對照組所見基本相同，星形膠質細胞在形態、數量和結構上未發生明顯變化。

正常對照組及干預組與模型組的GFAP陽性細胞個數在大腦(P＜0．05)、腦干(P＜0．01)、脊髓(P＜0．05)中存在明顯差異;而治療組與正常組的GFAP陽性細胞個數并無明顯差異(P＞0．05)。與正常組相比，模型組的星形膠質細胞數量呈明顯上升，而經過雄激素作用的治療組，其星形膠質細胞在數量上與正常組相比并無差異(P＞0．05)。這些結果表明雄激素對星形膠質細胞數量的增加及結構形態的變化都起到了抑制作用(見圖1)。

圖1 各組大鼠大腦、腦干、脊髓中GFAP陽性細胞個數的變化

3 討論

EAE是人脫髓鞘疾病MS經典的動物模型。EAE是由嚙齒類或靈長類動物的髓鞘素抗原進行免疫接種而誘導產生的，目前國內外學者廣泛采取此動物模型來研究多發性硬化，是國際上公認的多發性硬化癥研究的標準動物模型。常用于建立EAE模型的動物有SJL/J小鼠、B10PL小鼠、Lewis大鼠、豚鼠等，且上述動物模型在EAE模型建立中存在雌雄個體差異［5～7］。本實驗采用我國常見的非敏感系鼠Wistar大鼠，注射以豚鼠全脊髓和完全弗式佐劑自制成的混合乳劑(抗原)來制作多發性硬化動物模型［5］，模型組發病率為60%，與先前報道的Wistar大鼠對 EAE 具有一定的抵抗性一致［5，7］。

星形膠質細胞已經被證實在中樞神經系統起著神經調節、保護、pH平衡、神經發育過程中的軸突生長控制、內環境的穩定和血腦屏障維護等作用。近年來研究認為，星形膠質細胞在炎性脫髓鞘疾病髓鞘損傷早期異常活躍，髓鞘脫失后可激發明顯的星形膠質細胞反應［10，11］。星形膠質細胞是具有大量放射狀突起的小圓錐細胞，直徑為9～10μm，核大，呈圓形或卵圓形，染色質稀少，核仁不明顯;胞漿中除含有一般的細胞器外，尚含有許多由膠質絲(glial filament)組成的圓纖維結構，呈交錯排列，在突起中的走向與突起縱軸平行。GFAP是星形膠質細胞的主要成分，是星形膠質細胞的特異性標志物［8，9］。星形膠質細胞對中樞神經系統的病理性損害起應答反應，EAE模型中的GFAP反應明顯增強，反映了星形膠質細胞的數量及功能狀態同時受到了影響。星形膠質細胞的變化還反映在其表達的生長因子、堿性成纖維細胞因子等因子水平的變化上［10，11］。

性激素是影響星形膠質細胞形態、結構和功能的重要因素之一［3，4，12］。雄激素是一類含有 19 個碳原子的甾體激素，雄激素能促進和維持精子發生、促使雄性性征的出現并維持其正常狀態、作用于中樞神經系統、促進代謝和生長發育等功能。雄激素對不同腦區正常星形膠質細胞的形態及生物學行為，以及星形膠質細胞表達GFAP mRNA的水平等都有明顯的調節作用［7，13～15］。本實驗研究鏡下可見模型組大鼠在發病急性期可見胞體明顯增大，突起增長和增粗，GFAP免疫反應明顯增強，治療組大鼠與正常對照組所見基本相同。統計學也表明，模型組與治療組GFAP陽性細胞個數差異有統計學意義(P＜0．01)，模型組與正常對照組GFAP陽性細胞個數差異也是有統計學意義(P＜0．01)，治療組與正常對照組GFAP陽性細胞個數差異沒有統計學意義(P＞0．05)。說明在EAE的發病過程中中樞神經GFAP表達明顯增加，在雄激素的干預下，治療組中GFAP表達減少，與正常對照組無顯著差異。睪丸酮可能通過直接作用于神經元的雄激素與雌激素受體而間接實現其對星形細胞的影響。睪丸酮對星形細胞的調節可能也存在著直接作用途徑。但Chowen等人［14］的研究也發現，性激素對正常大鼠星形細胞的數量沒有顯著影響，這種不一致的原因尚不清楚，是否與睪丸酮促細胞分裂、增殖作用存在組織差異性，有待進一步研究。

本實驗應用雄激素干預EAE，可見雄激素治療組HE與髓鞘染色改變沒有模型組明顯;治療組的發病率低于模型組，潛伏期長于模型組(P＜0．05)，臨床評分雖然治療組(1．56±0．99)低于模型組(1．87±0．73)，但統計學上無顯著差異性，雄激素在改善臨床癥狀的效果不是很明顯，可能與樣本例數偏少有關，存在一定的誤差有關。總之，實驗結果表明，雄激素對EAE在治療上有一定的效果，但關于EAE及MS存在性別上的差異和雄激素在其中的作用機制目前仍不清楚［16～18］，隨著進一步的研究，將會有更全面的認識，從而發現更有效的治療方法。

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