經鼻給予TGF－β1對匹羅卡品誘導的癲癇持續狀態大鼠海馬內炎癥反應的影響

劉益民， 韓遠遠， 張慧敏， 王 玉

癲癇是神經系統第三大慢性腦功能障礙疾病［1］，嚴重影響患者的生活質量。諸多因素參與了癲癇發生、發展過程，近年來越來越多的實驗和臨床研究表明炎癥反應和免疫調節為癲癇的重要病理機制［1～3］。轉化生長因子-β1(TGF-β1)是一種多功能的細胞生長因子，參與調節細胞生長、分化和細胞損傷的修復，并可以抑制中樞神經系統內的炎癥反應和免疫反應［4，5］。癲癇形成的過程中，TGF-β1 可能具有潛在的神經保護及抗炎作用。由于內源性TGF-β1在腦中含量較低，在癲癇形成的超早期，補充TGF-β1可能發揮神經保護及抑制中樞炎癥反應，防治癲癇的作用。本實驗在匹羅卡品誘發的癲癇持續狀態(SE)后，采取可以繞過血腦屏障直接進入腦內的經鼻給藥方式給予TGF-β1，動態監測海馬炎性因子白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達水平及小膠質細胞活化物CD11b的改變，探討TGF-β1在癲癇形成過程中對神經炎癥的影響及可能的機制。

1 材料和方法

1．1 實驗動物

選用清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠84只(安徽醫科大學動物實驗中心提供)，6～8周齡，體重160～240g。實驗動物均在安靜的室溫下飼養1w以適應環境，自由進食飲水，適宜濕度及溫度，自然晝夜節律光照。

1．2 化學試劑

重組人TGF-β1蛋白購自美國Peprotech公司，鹽酸匹羅卡品購自美國Sigma公司，Elisa試劑盒均購自美國Invitrogen公司，免疫組化用小膠質細胞標志物CD11b/integinαM多克隆兔抗及二抗試劑盒購自北京博奧森公司。

1．3 實驗方案、匹羅卡品癲癇模型的建立及分組

實驗一:為檢測TGF-β1能否經滴鼻順利進入大腦中樞，動物分為 TGF-β1組和對照組(control組)，每組3只。滴鼻方法:25μg TGF-β1重組人蛋白(Peprotech，USA)溶于 40μl消毒 PBS(pH7．4，0．5μg/μl)中。給藥方法參照 Jiang 等人［6］的方法稍有改變:大鼠用戊巴比妥鈉腹腔麻醉(200mg/kg)，取仰臥位，頭頸背用4×4cm的紗布卷稍墊高以有利于藥物進入后鼻腔，應用移液槍經鼻滴入TGF-β1(2μl/只)。當一側鼻孔給藥時，大鼠的另一側鼻孔被輕輕的堵住。對照組應用相同方法滴入等容量的PBS。

實驗二:匹羅卡品動物癲癇模型的建立及分組:大鼠接受單次的匹羅卡品腹腔注射(380mg/kg)，致癇前30min皮下注射了甲基-東莨菪堿1mg/kg以減弱匹羅卡品膽堿能反應。大鼠行為學觀察參照Racine［7］六級評價標準:Ⅰ級:出現面部抽搐伴咀嚼動作，偶爾的“濕狗樣動作”;Ⅱ級:出現點頭運動，一側前肢陣攣、頻繁的“濕狗樣動作”;Ⅲ級:出現雙側前肢陣攣、流涎、站立;Ⅳ級:全身陣攣，失去平衡跌倒;Ⅴ級;癇性發作持續。周期性重復的Ⅲ級及以上級別、持續達30min界定為SE發作。匹羅卡品注射后約20min，所有動物均出現SE發作。在SE后90min，腹腔注射地西泮10mg/kg后SE逐漸終止。死亡率被統計于癲癇持續狀態后6h，24只動物死于癲癇持續狀態(死亡率約30%)。此時把動物隨機分為3組:正常對照組(Control組，n=18)、匹羅卡品+PBS滴鼻組(Pilo組，n=18)、匹羅卡品+TGF-β1滴鼻組(TGF組，n=18)3組，各組又隨機分為1d、3d、7d 3 個亞組，每組6 只。

1．4 組織處理

實驗一部分，實驗動物滴鼻后1h，10%水合氯醛麻醉后(350mg/kg，腹腔注射)快速斷頭取腦，完整腦組織被取出后存于液氮罐中備Elisa定量檢測。

實驗二部分，各實驗組動物分別于SE后1d、3d、7d，10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，冰盤內沿矢狀線直切成對半，一側半球的海馬組織被離斷，存于液氮罐中備細胞因子Elisa定量檢測;另一側半球放入4%甲醛溶液中固定72h，之后組織脫水、石蠟包埋，連續的海馬冠狀切面進行切片，片厚4μm。

1．5 Elisa定量測定

液氮罐中取出標本，保持低溫條件下，各組標本稱重后按一固定比例生理鹽水稀釋，勻漿后移入離心管，4℃低溫離心20min(3000r/min)，離心后取上清液測定。Elisa法分別檢測實驗一部分的重組蛋白TGF-β1及實驗二部分的細胞因子IL-1β、TNF-α蛋白的檢測，具體方法按說明書進行:配標準品，留空白孔，分組加樣品及標準品，洗板，加生物素化抗體工作液，洗板，加酶結合物工作液，洗板，加洗滌液，洗板，加顯色液，加終止液等;測量 OD450值(10min內);通過Curve Expert 1．3分析軟件繪制標準曲線:由標準方程求出 TGF-β1、IL-1β 及 TNF-α蛋白的含量。

1．6 免疫組織化學反應

按SP三步法法進行免疫組化染色，切片常規脫蠟至水，抗原熱修復后依次加入3%H2O2、10%山羊血清閉液，之后加 CD11b/integinαM 抗體(1∶1000)，于4℃冰箱過夜后，滴加二抗工作液及辣根酶標記物，DAB顯色。陰性對照用PBS代替一抗。

1．7 圖像采集及免疫組化圖像分析

圖像采集在Olympus公司提供的自動聚焦顯微鏡下完成，采用同一曝光度，高倍鏡下隨機抽取每張切片的CA1區5個不同高倍視野用于攝片及分析，分析使用IPP 6．0圖像分析軟件(Media Cybernetics MD，USA)自動分析每張圖片的平均光密度。

1．8 統計學處理

2 結果

2．1 滴鼻檢測

實驗一中，TGF-β1組滴鼻后1h處死動物，對腦組織勻漿液進行Elisa定量檢測。結果顯示TGF-β1組和對照組有明顯差異(n=3，3．24 ±0．31 Vs 0．17±0．04ng/g，P＜0．01)，表明 TGF-β1 滴鼻后 1h，蛋白在腦內明顯聚集。

2．2 IL-1β、TNF-α 蛋白檢測結果

各實驗組 IL-1β、TNF-α蛋白的含量具體見表1、表2。對照組大鼠海馬IL-1β、TNF-α蛋白含量甚微;SE 后 1d、3d、7d，TGF 組較 Pilo 組 IL-1β、TNF-α含量均有減少，差異有統計學意義(P＜0．05或P＜0．01)。通過 Pilo組和 TGF組 IL-1β、TNF-α 蛋白組內各時間點比較發現，隨SE后時間的延長，Pilo組這兩種細胞因子蛋白含量呈先上調后下降趨勢，3d為高峰，7d含量明顯高于1d含量(P＜0．05或P＜0．01)，TGF組各時間點細胞因子含量變化趨勢與Pilo組相一致。

2．3 CD11b形態及平均光密度值比較

各組大鼠海馬區CD11b陽性表達見圖1。對照組大鼠海馬CD11b陽性細胞表達較少，胞體呈圓形或橢圓形，突起較少。Pilo組和TGF組陽性細胞著色較深，部分細胞胞體演變成狹長狀及梭狀，突起增多、增粗，以致癇后7d最為明顯。平均光密度值比較(見表3)，Pilo組隨SE后各時間點的延長，呈快速增加趨(P＜0．01)，TGF組的變化趨勢與Pilo組相一致(P＜0．05或P＜0．01)。TGF組與 Pilo組比較，在1d平均光密度無明顯差異(P＞0．05)，3d有明顯差異(P＜0．05)，7d存在顯著差異(P＜0．01)。

表3 各組大鼠不同時間海馬CD11B表達的平均光密度值(χ ± s，n=6)

圖1 癲癇持續狀態后各組大鼠海馬CA1區CD11b的表達

3 討論

TGF-β1是一種多功能細胞因子，可以通過細胞表面的受體信號轉導，參與細胞的增殖分化、炎癥反應和細胞損傷的修復等［8］。內源性的神經營養因子，包括TGF-β1，由于在體內的含量較低，對機體的各種創傷的修復和免疫調節作用并不明顯［9］。近年來的研究表明，TGF-β1 對帕金森病［10］、阿爾茨海默病［11］、亨廷頓病［12］、腦缺血［13］等中樞神經變性疾病有一定的腦保護作用。并且大量研究表明TGF-β1可以抑制中樞內的炎癥反應［4，5，14］。外源性 TGF-β1的補充可能具有神經保護及抑制中樞炎癥反應的作用，為癲癇的防治帶來新的希望，然而TGF-β1作為一種大分子多肽類物質，周圍用藥很難通過血腦屏障，用藥途徑制約著包括TGF-β1在內的神經營養因子的研究和應用。近年來，大量研究證實滴鼻可以使一些大分子多肽類物質或某些藥物繞過血腦屏障快速到達中樞［15，16］。較多實驗證實這條路徑是沿嗅覺和三叉神經傳導通路進行傳導［17］。本實驗中，在TGF-β1滴鼻后1h，腦內即有很高的聚集，提示鼻腔給藥可使藥物快速到達中樞，這與Ma YP等報道相一致［18］。滴鼻成為中樞神經系統疾病實驗研究和潛在的的臨床治療應用策略，有效的使藥物繞過血腦屏障，靶向遞送到腦部，比其他中樞給藥具有較多的優勢［15］。

癲癇的發生、發展與炎癥反應和免疫調節密切關聯［1，2］。IL-1β 是急性應激反應和損傷的重要炎性介質之一，腦內局部IL-1β增高可加重腦組織的炎癥引起驚厥［19］。IL-1β還可以激活血管內皮細胞、中性粒細胞等，增強粘附分子表達，促進其他細胞因子如IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等釋放，與TNF-α一起引起各種炎癥反應，進而誘發或加重驚厥。TNF-α是一種經典促炎細胞因子，在正常腦組織中表達甚微，當各種中樞神經系統疾病如腦缺血、癲癇等發生時會出現快速上調。TNF-α能夠調整突觸的傳遞，尤其是膠質細胞釋放的TNF-α，可以通過調整神經元表面的AMPA受體，加快突觸的傳遞;并且通過與不同受體結合，調整與谷氨酸能系統相互作用，影響神經興奮性，進而影響癲癇發生的敏感性［20，21］。本實驗中各時間點，TGF組較Pilo組促炎細胞因子IL-1β、TNF-α的分泌表達減少明顯，不僅提示TGF-β1可能減弱了海馬內炎癥反應的強度，更提示TGF-β1可能具有潛在的抗癲癇作用。

包括癲癇在內的中樞神經系統疾病中，區域性的星形膠質細胞和小膠質細胞的活化是其重要的病理特征，并且這些細胞是炎癥介質產生的主要來源［1］。在顳葉癲癇手術切除的海馬組織中就存在活化的星形膠質細胞、小膠質細胞及相關的炎性介質［22］。腦內的膠質細胞，尤其是小膠質細胞，為中樞神經系統免疫信號轉導的主要細胞類型，為中樞疾病研究的熱點［8］。在 SE 后 3d和 7d，TGF-β1滴鼻處理組較Pilo組小膠質細胞平均光密度值有明顯差異，提示TGF-β1抑制了SE引起的小膠質細胞的活化。關于TGF-β1抑制中樞內小膠質細胞活化、減輕腦內炎癥的作用，曾見于以前的報道［4，5］。本實驗中，外源性的 TGF-β1抑制了細胞因子 IL-1β、TNF-α蛋白的合成，并抑制了小膠質細胞的活化，提示應用TGF-β1處理，減弱海馬部位的炎癥應答。SE后1～3d為匹羅卡品癲癇模型的急性期，3～7d為癲癇形成期或稱潛伏期［22］。在癲癇形成的關鍵期內海馬區的炎癥反應得到抑制，尤其是促炎細胞因子 IL-1β、TNF-α 的分泌表達減少，提示 TGF-β1處理可能會對癲癇腦損傷具有保護作用。

綜上所述，經鼻給予TGF-β1可以減少癲癇持續狀態大鼠海馬炎性因子IL-1β、TNF-α的表達，抑制了小膠質細胞的活化，減輕海馬內的炎癥反應，可能具有腦保護及抗癲癇的作用。具體的機制仍有待于進一步研究。

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