延髓缺血對其微血管密度、神經元及神經膠質細胞的影響

朱 江， 郭 森， 孫艷軍， 馮亞茹， 來 錦

隨著全球人口老齡化的到來，腦血管病特別是缺血性腦卒中發病率日益增高。臨床常見的缺血性腦血管病［1，2］，都是由頸內動脈系統或椎-基底動脈系統的某一分支病變引起的。其中，椎-基底動脈系統缺血性疾病占缺血性腦卒中的 20%［3，4］。延髓(medulla oblongata)是人類的生命中樞，含有大量神經元，神經元周圍有神經膠質細胞填充。正常生理情況下，神經元、膠質細胞和毛細血管緊密結合在一起，星形膠質細胞突起伸展填充在神經元胞體及其突觸之間［5］。在后循環缺血過程中延髓內微血管及神經元、神經膠質細胞的病理改變尤其值得關注。本研究通過阻斷大鼠相應血管模擬后循環缺血后的病理過程，建立延髓缺血模型，應用單寧酸-氯化鐵媒染法［6～8］、HE染色等方法觀察缺血后不同時段延髓內微血管、神經元和神經膠質細胞的改變，為后循環缺血［9］的診斷治療提供形態學資料。

1 材料和方法

1．1 材料 SPF級Wistar成年健康雄性大鼠，200～220g(由河北醫科大學實驗動物中心提供)。10%多聚甲醛固定液、0．1mol PB溶液、單寧酸(tannic acid)、氯化鐵(FeCl3)、蘇木精、伊紅、10% 水合氯醛、青霉素、高頻電刀、顯微手術器械、分析天平、冰凍切片機、光學顯微鏡、顯微鏡及攝像裝置。

1．2 實驗方法

1．2．1 實驗動物分組 48只大鼠隨機分為4組:即實驗組(1w組、2w組、3w組)和對照組，每組12只。其中實驗組大鼠阻斷雙側椎動脈及右側頸總動脈。存活時間分別是1w、2w、3w。對照組只暴露雙側椎動脈及右側頸總動脈，不做血管阻斷處理。

1．2．2 延髓缺血模型制備 結扎右側頸總動脈:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350mg/kg)，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露右側頸總動脈并結扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動脈:大鼠俯臥固定，于后正中線第一頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第一頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內凝閉椎動脈3～4s，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養。

1．2．3 HE染色標本制作、單寧酸-氯化鐵染色標本制作 按文獻［10］方法取出延髓標本，進行HE染色標本制作。按文獻方法［6］制作單寧酸-氯化鐵染色標本。

1．2．4 神經元、神經膠質細胞計數及微血管密度定量分析方法 每只大鼠取4張切片，每張切片在200倍光鏡下隨機選取5個視野，輸入醫學顯微圖像分析系統(MiVnt)進行圖像處理，計數神經元、神經膠質細胞，取其平均值為這只大鼠的神經元、神經膠質細胞的細胞數。每只大鼠取3張切片，采用Mivnt圖像分析系統定量分析延髓微血管密度(microvessel density，MVD)和微血管面積比(microvessel aera density，MVA)。每張切片在100倍光鏡下選5個視野，分別計算MVD值和MVA值，取平均值作為該只大鼠延髓微血管的MVD值和MVA值。

1．2．5 統計學處理 用 S PSS13．0統計軟件包處理，數據用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05有統計學意義。

2 結果

2．1 延髓缺血動物模型的建立 電凝雙側椎動脈并結扎右側頸總動脈，建立了延髓缺血模型。

2．2 延髓缺血模型腦組織大體標本觀察 雄性Wistar大鼠共48只，其中觀察實驗組36只，對照組12只動物。在大體標本上可見，第一周大腦橫裂較對照組略顯增寬，雙側大腦半球基本對稱。第2周大腦橫裂較第1周的略有增寬，右側大腦半球較左側略萎縮，小腦可見萎縮。第3周大腦橫裂顯著增寬，小腦萎縮明顯，雙側大腦半球不對稱，右側萎縮明顯。取材時可見，腦組織與顱骨之間空隙增寬，第四腦室略有擴大。本次試驗采取阻斷雙側椎動脈并結扎右側頸內動脈法進行相應的比較，大體標本實驗動物延髓處可見明顯缺血表現，實驗各組的缺血部位較對照組明顯萎縮(見圖1、2、3、4)。

2．3 延髓缺血模型微血管密度(MVD)、微血管面積比(MVA)變化 通過對實驗各組1w、2w、3w的觀察，延髓微血管密度(MVD)增加(47．28 ±8．67，61．92 ±11．37，78．33 ±14．62)，與對照組(104．16 ±15．63)相比較P＜0．05，P＜0．01;微血管面積比(MVA)增大(0．0246 ±0．0048，0．0366 ±0．0098，0．0399 ±0．0131)，與對照組(0．0614±0．0018)比較P＜0．05或P＜0．01，二者均有明顯的統計學差異(見表1、2)。

2．4 延髓缺血對神經元的影響 實驗組中，通過對1w、2w、3w后試驗動物的觀察，神經元數量減少(4．35 ±2．61，4．32 ±1．83，3．91 ±0．78)，與對照組(8．60 ±2．82)相比較(P＜0．05)，統計學差異明顯(見表3)。

2．5 延髓缺血對神經膠質細胞的影響 實驗各組神經膠質細胞數量增加(21．25 ±4．56，29．56 ±3．65，48．36 ±5．32)，與對照組(15．34 ±2．56)相比較P＜0．05或P＜0．01，有非常顯著的差異(見表4)。

2．6 組織學觀察

2．6．1 對照組:微血管、神經元、神經膠質細胞形態基本正常，細胞膜完整，核膜、核仁清晰，尼氏體豐富。

表1 各組MVD值變化情況(±s)

表1 各組MVD值變化情況(±s)

與對照組組內比較*P ＜0．05，＊＊P ＜0．0

組別 數量 MVD(100倍視野)對照組實驗1w組實驗2w組實驗3w組12 12 12 12 104．16 ±15．63 47．28 ±8．67＊＊61．92 ±11．37＊＊78．33 ±14．62*

表2 各組MVA值變化情況(±s)

表2 各組MVA值變化情況(±s)

與對照組組內比較*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 數量 MVA(100倍視野)對照組實驗1w組實驗2w組實驗3w組12 12 12 12 0．0614 ±0．0018 0．0246 ±0．0048＊＊0．0366 ±0．0098＊＊0．0399 ±0．0131*

2．6．2 實驗組:(1)1w組微血管閉塞，數量減少，血管內皮細胞腫脹，膜結構不清，甚至斷裂。神經元數量減少，核固縮、碎裂、溶解，細胞器溶解消失。神經膠質細胞數量增加，細胞排列緊密，細胞核較大，有明顯核仁。(2)2w組神經元較1w組數量略減少，神經元溶解消失。神經膠質細胞增加明顯，壞死區域內可見大量神經膠質細胞填充，細胞較大，核較小，顏色較淺。(3)3w組微血管量增加，內皮細胞正常，神經元數量減少，壞死性病灶內神經元破碎，甚至完全消失。神經膠質細胞數量明顯增多，仍處于增殖狀態，在一些受損的神經元周圍出現的神經膠質細胞，細胞核深染，排列較雜亂((見圖5～圖12)。

表3 神經元數量(±s)

表3 神經元數量(±s)

與對照組組內比較*P＜0．05

組別 數量 神經元數量(200倍視野)對照組實驗1w組實驗2w組實驗3w組12 12 12 12 8．60 ±2．82 4．35 ±2．61*4．32 ±1．83*3．91 ±0．78*

表4 神經膠質細胞數量(±s)

表4 神經膠質細胞數量(±s)

與對照組組內比較*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 數量 神經膠質細胞數量(200倍視野)對照組實驗1w組實驗2w組實驗3w組12 12 12 12 15．34 ±2．56 21．25 ±4．56*29．56 ±3．65＊＊48．36 ±5．32＊＊

3 討論

腦干的血液供應復雜，大部分的血供來源于椎-基底動脈系統。以往的研究，應用阻斷基底動脈的方法建立腦干缺血的實驗模型。Miura等［11，12］應用雙點電凝基底動脈建立腦干缺血模型。上述實驗，術中需開顱，術式復雜。同時考慮直接阻斷基底動脈，實驗動物會瞬間出現意識障礙、抽搐、呼吸淺快等表現，存活率較低。本實驗考慮，大鼠雙側椎動脈延伸匯成基底動脈，試用電凝雙側椎動脈的方法建立延髓缺血模型。但通過預實驗發現，延髓缺血病灶不固定。考慮這與大鼠腦動脈環完整、相應的血流代償機制完善有關。

參考以上實驗方法，本研究嘗試多點阻斷腦動脈法即同時阻斷雙側椎動脈及右側頸總動脈，建立延髓缺血模型。上述方法對實驗動物的條件要求單一，術式易操作。電凝雙側椎動脈，不需開顱，操作簡單安全，能較確切的對血管進行阻斷。直接結扎右側頸總動脈，不應用線栓法，可避免血管穿通出現的繼發蛛網膜下腔出血等副損傷。實驗證明，在大體標本上不經任何染色就可清晰直觀的看出腦組織的萎縮。微血管構筑、神經元、神經膠質細胞也發生明顯的形態學改變。因此，該模型具有缺血部位固定、重復性較好、成活率較高的優點。

腦梗死后新生微血管增生的機制還不十分明確。利用微血管特定的標記物質，如CD31等標記新生微血管觀察發現［13，14］，在腦梗死后1w可見相關陽性標記物出現，在隨后的2w、3w內新生微血管的密度不斷增加。特別是在腦梗死后的第2周，新生微血管標記物陽性率最高。在形態學方面，不論是通過普通光學顯微鏡、還是應用激光共聚焦三維重建等技術，都可以發現在腦梗死1w時，會出現部分微血管閉塞，甚至可以看見微血管內皮細胞的斷裂等現象，但在隨后的2w、3w微血管形態學較對照組未見明顯變化［15］。本實驗結果與之有相似之處，通過微血管密度、微血管面積比可證實，缺血2～3w血管明顯增多，增多的血管可能是新生的血管，今后的實驗可通過相應的標記加以證實。筆者認為，在了解新生微血管隨腦梗死的時間變化規律基礎上，對微血管總體密度的統計，更加直觀的反映出腦梗死對微血管的影響。經試驗研究顯示，延髓缺血后1w，微血管密度減低;2w時微血管的密度明顯升高，較對照組少;3w時微血管密度進一步升高，仍少于對照組。

作為腦組織細胞中重要組成部分，神經膠質細胞發揮著重要的作用，如清除自由基、為突觸再生提供穩定的離子狀態、提供生長因子等。本研究提示，延髓缺血后神經膠質細胞總體處于增殖狀態。1w時神經膠質增殖，數量較對照組增加，神經膠質細胞之間排列緊密，細胞核較大而致密，有的病灶中心可見神經膠質細胞充斥。2w時表現為神經膠質細胞在數量上仍保持增加的趨勢，可見在神經元周圍的神經膠質細胞，排列較整齊，膠質細胞的細胞核深染，細胞核較小，顏色致密。3w時神經膠質細胞進一步增殖，數量顯著高于對照組。在一些皺縮的神經元周圍出現的神經膠質細胞，細胞核深染，排列較雜亂。膠質細胞數量在延髓缺血發生后3w內總的變化趨勢是始終處于增殖狀態。通過實驗研究發現，神經膠質細胞與微血管密度的變化方面有一部分時段變化方向相同，即在腦缺血發生后的第2、3周，神經膠質細胞數量與微血管密度在數量上統計均處于持續增長的狀態。腦缺血性疾病后微血管的擴張、增生相關機制目前還處于研究階段。缺血時在大鼠腦神經膠質細胞釋放諸多如PGI2等［16］神經介質，這些神經介質可能會為腦組織中新生微血管增生提供條件，成為對缺血條件下腦組織的相應的保護機制。但兩者之間是否存在相關性及更深一步增殖機制有待研究。

神經膠質細胞，特別是星形膠質細胞在維持腦細胞內環境方面有重要功能，同時還擔負著為神經元供能、提供營養因子的職責。缺血誘導的神經膠質細胞的增生在實驗后第一周可見。在2w、3w的研究觀察中，神經元出現崩解現象。在缺血條件下，神經膠質細胞大量增生會影響到微循環，引起局部微循環障礙。從而進一步加重神經元的缺血缺氧表現，在持續低灌注狀態下會出現大量神經元胞體破碎、凋亡。

實驗結果提示，在腦缺血條件誘導下，延髓內部微血管、神經元、神經膠質細胞之間存在相互影響。隨著延髓缺血時間的延長，神經膠質細胞的增生為微血管的新生提供了必要的基礎。同時微血管的增生本身也為神經膠質細胞的增殖提供能量的貯備。實驗時間進一步推移，神經膠質細胞大量增生后，出現了病灶局部的微循環改變，出現局部微循環障礙，導致神經元的減少，考慮出現遲發性神經元死亡。

圖1 對照組

圖2 實驗1w組

圖3 實驗2w組

圖4 實驗3w組

圖5 對照組HE×200

圖6 實驗1w組HE×200

圖7 實驗2w組HE×200

圖8 實驗3w組HE×200

圖9 對照組TA-FE×100

圖10 實驗1w組TA-FE×100

圖11 實驗2w組TA-FE×100

圖12 實驗3w組TA-FE×100

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