GRP78、CHOP、caspase-3和 caspase-9蛋白在缺血預處理大鼠腦組織中的表達及意義

閔鶴鳴， 魯璐清， 王文娟， 武曉寧， 閔連秋

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion)損傷是一種重要的由于供血障礙引起的應激性疾病［1］，血供中斷后一定時間內恢復，可引起缺血組織發生較血供恢復前更嚴重的損傷。有研究證明腦缺血/再灌注后存在內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，且與神經元凋亡有關［2，3］。caspase 家族是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，其中caspase-9為凋亡啟動酶，caspase-3為凋亡效應酶。2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose，2-DG)是一種內質網的保護性蛋白GRP78的誘導劑，可以誘導ERS的發生。本研究從ERS的角度探討腦缺血預處理在缺血/再灌注大鼠腦損傷中的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1．1 動物與分組 健康雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，體重280～320g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(遼)2003-0007。隨機分為腦缺血預處理組:缺血預處理30min，再灌注3d，再次缺血2h，再灌注24h處死大鼠;2-DG預處理組:2-DG溶于雙蒸水，工作濃度為50mg/ml，按照100mg·kg-1·d-1的劑量給予大鼠腹腔注射，每天一次，連續7d后進行假手術處理，再灌注3d，缺血2h，再灌注24h處死大鼠;腦缺血/再灌注組:假手術處理，再灌注3d，缺血2h，再灌注24h處死大鼠;對照組:第一次假手術后再灌注3d，第2次假手術后再灌注24h處死大鼠。每組12只。

模型制備:參照 Longa［4］和 Nagasawa［5］報道的方法加以改進制備大鼠大腦中動脈(MCA)局灶性腦缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛350mg·kg-1腹腔注射麻醉，頸部正中切口，分離并結扎左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)和ICA的顱外分支-翼腭動脈。將ICA遠心端用動脈夾夾閉，距CCA分叉處近心端0．5cm處將CCA剪一小口，插入碳素魚線，松開動脈夾，向ICA插入魚線(20±2)mm，直至稍感阻力，栓線進入ICA后，穿過MCA起始端至大腦前動脈近端，阻斷MCA的所有血流來源，扎緊備線，外留10mm線頭。30min后輕輕提拉所留線頭，拔出5mm，使血流再通，形成再灌注，將栓線尾部埋在皮下，縫合切口，再灌注3d后用相同方法進行缺血及再灌注。模型成功的標準為大鼠清醒后出現左側Horner征及對側以前肢為主的癱瘓，神經行為學評分在1～3分［4］。假手術為僅暴露CCA、ECA及ICA，栓線插入CCA及ICA但不阻斷MCA，術前禁食12h，術中及術后維持體溫在37℃左右，術后單籠飼養。

1．2 藥品和試劑 GRP78、CHOP和 caspase-9多克隆一抗購于北京博奧森生物技術有限公司;caspase-3多克隆一抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司;2-DG購于天津致遠化學試劑有限公司;免疫組化試劑盒和顯色試劑盒由北京博奧森生物技術有限公司和北京中杉金橋生物技術有限公司提供;TUNEL細胞凋亡試劑盒由南京凱基生物發展有限公司提供。

1．3 檢測指標

1．3．1 神經行為學評分 采用 Z ea Longa［4］6級5分制評分標準進行神經行為學評分。

1．3．2 腦梗死體積測定 進行神經行為學評分后將大鼠斷頭處死，迅速取出左腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，于－20℃冰箱中速凍2min，將大腦作連續2mm冠狀切片，共6片，然后將腦片放入2%TTC磷酸鹽緩沖液中37℃恒溫孵育1h，正常腦組織染為紅色，梗死灶呈白色。數碼相機拍照后，應用病理圖像分析儀測量腦梗死面積。根據公式V=(A1+---+An)t/2算出梗死體積，其中t為切片厚度，A為梗死面積［6］。

1．3．3 腦含水量的測定 采用干、濕重法，動物在規定時相點處死，斷頭取腦，分別取兩側大腦半球腦組織標本，先用電子天平稱取濕重，然后將標本置于95℃ ～100℃紅外線干燥箱內烘干24～48h至恒重，稱取干重。腦含水量用濕重的百分比表示，即腦含水量(%)=(濕重－干重)/濕重×100%。

1．3．4 免疫組化檢測缺血區腦組織 G RP78、CHOP、caspase-3和caspase-9蛋白表達 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法。石蠟切片常規脫蠟至水，3%雙氧水室溫處理10min，微波加熱抗原修復，自然冷卻至50℃，去除過氧化物酶，去除背景染色，加 GRP78、CHOP、caspase-3 和caspase-9一抗，4℃過夜;加生物素化地高辛抗體，置于恒溫箱中 3 0min，加 S ABC，37℃，40min，DAB 顯色，顯微鏡下控制時間;蘇木素復染，中性樹膠封片，鏡下觀察。

2 結果

2．1 各組大鼠神經行為學評分的變化 與對照組相比，其余3組大鼠的神經行為學評分差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預處理組和2-DG預處理組的神經行為學評分明顯降低，差異具有顯著性(P＜0．01);而腦缺血預處理組和2-DG預處理組之間的神經行為學評分無顯著性差異(P＞0．05)(見表1)。

2．2 各組大鼠腦梗死體積的變化 與對照組相比，其余3組大鼠腦梗死體積差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預處理組和2-DG預處理組的腦梗死體積明顯縮小，差異具有顯著性(P＜0．01);而腦缺血預處理組和2-DG預處理組之間的腦梗死體積變化無顯著性差異(P＞0．05)(見表1)。

2．3 各組大鼠腦含水量的變化 與對照組相比，其余3組大鼠腦含水量差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預處理組和2-DG預處理組的腦含水量明顯降低，差異具有顯著性(P＜0．01);而腦缺血預處理組和2-DG預處理組之間的腦含水量無顯著性差異(P＞0．05)(見表1)。

2．4 免疫組化檢測大鼠腦組織GRP78、CHOP、caspase-3和caspase-9蛋白的表達 光學顯微鏡下觀察，GRP78陽性染色細胞呈棕黃色，染色位于胞漿，細胞形態大部分正常，形態相對飽滿，呈圓形或橢圓形。對照組的GRP78陽性染色細胞表達不明顯;與對照組相比，其余3組的GRP78陽性染色細胞表達明顯增加，差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預處理組和2-DG預處理組的GRP78陽性染色細胞表達明顯增加，差異非常顯著(P＜0．01);而腦缺血預處理組和2-DG預處理組之間的GRP78陽性染色細胞表達無顯著性差異(P＞0．05)。CHOP陽性染色細胞胞漿呈現棕黃色淡染，細胞核也呈現棕色，多數細胞核發生形態學改變，胞核皺縮，呈梭形或條索狀;caspase-3陽性染色細胞為胞核染色呈棕黃色，可見細胞皺縮、變形，體積變小;caspase-9陽性染色細胞呈棕黃色，胞漿胞核均有表達，但以胞核表達為主，部分細胞可見細胞壞死的形態改變及染色質濃縮。對照組的 CHOP、caspase-3和caspase-9陽性染色細胞僅有微量表達;與對照組相比，其余 3組的 CHOP、caspase-3和caspase-9陽性染色細胞表達明顯增加，差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預處理組和 2-DG預處理組的 CHOP、caspase-3和caspase-9陽性染色細胞表達減少，差異非常顯著(P＜0．01);而腦缺血預處理組和2-DG預處理組之間的CHOP、caspase-3和caspase-9陽性染色細胞表達無顯著性差異(P＞0．05)(見表2)。

表1 各組大鼠神經行為學評分、腦梗死體積和腦含水量的變化(χ ± s ，n=6)

表2 各組大鼠GRP78、CHOP、caspase-3和caspase-9蛋白的表達(±s，n=6)

表2 各組大鼠GRP78、CHOP、caspase-3和caspase-9蛋白的表達(±s，n=6)

與對照組相比△P＜0．01;與腦缺血再灌注組相比*P＜0．01

組別GRP78 CHOP caspase-3 caspase-9對照組腦缺血/再灌注組腦缺血預處理組2-DG預處理組35．77 ±0．49 114．89 ±0．67△155．54 ±0．83△＊156．08 ±0．89△＊5．39 ±0．37 85．163．20△71．201．87△＊70．502．18△＊161．89 ±1．44 231．28 ±2．19△208．54 ±1．56△＊207．42 ±1．42△＊172．47 ±2．09 295．37 ±3．17△256．45 ±2．47△＊254．52 ±2．63△△＊＊

3 討論

內質網是細胞內重要的亞細胞結構，為蛋白質合成、翻譯后修飾、折疊、寡聚化而形成正確構象及分泌的場所，還參與脂質代謝和類固醇激素的合成、鈣的儲存等。正常情況下，內質網內環境的穩定是實現其功能的基本條件，因此內質網具有極強的內穩態體系。盡管如此，仍有很多因素可導致內質網功能的內穩態失衡，引發ERS。缺血/再灌注時缺氧、酸中毒、ATP耗竭、鈣超載及大量自由基生成等均可作為誘導ERS的刺激因素，ERS在缺血/再灌注損傷的發生發展中具有重要意義［7］。

GRP78和CHOP是ERS的2個經典標志物［8］。GRP78在ERS時表達上調，是ERS的標志性蛋白和保護性因子，可促進內質網中未折疊蛋白正確折疊、修飾，具有在應激狀態下保護內質網功能的作用［8～10］。GRP78 還具有維持細胞內鈣平衡的作用［11］。CHOP是內質網相關促凋亡蛋白，在正常細胞中表達很低，但是在ERS時下被大量誘導表達，激活細胞凋亡途徑［12，13］。

腦缺血預處理是指對腦預先進行短暫的、一次或多次亞致死性缺血預處理，可以減輕24h后發生的致死性腦缺血再灌注所造成的損傷，產生神經保護作用。本研究發現，30min局灶性腦缺血預處理再灌注后，可以明顯降低大鼠缺血2h后再灌注24h的神經行為學評分、縮小腦梗死灶體積和降低腦組織含水量;與腦缺血/再灌注組相比，預處理缺血組GRP78的蛋白表達明顯增加，CHOP的蛋白表達明顯減少，與2-DG預處理組相似，推測腦缺血預處理可能觸發了體內的ERS過程，對隨后而發生缺血/再灌注所造成損傷的具有神經保護作用。

caspase家族是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，細胞凋亡的最后實施是通過caspase的激活而實現的［14］。ERS 時 caspase 被特異性激活［15］，其激活過程表現為級聯反應:即先激活凋亡始動子caspase-9，再激活凋亡效應子caspase-3，作用于特異性的底物引起細胞的凋亡。本研究同時發現，與對照組相比，腦缺血再灌注組、腦缺血預處理組和2-DG預處理組的caspase-3和caspase-9蛋白的表達量明顯增加，表明腦缺血/再灌注損傷能引起 caspase-3和caspase-9蛋白的活化，啟動的細胞凋亡途徑以caspase-3和caspase-9表達上調為主，提示caspase-3和caspase-9的激活在腦缺血/再灌注損傷中發揮重要作用，并可能與細胞凋亡有關;而腦預處理缺血組和2-DG預處理組caspase-3和caspase-9的表達量明顯少于腦缺血/再灌注組，進一步提示腦預處理缺血通過抑制caspase-3和caspase-9的激活，減輕了神經元的凋亡，對大鼠腦缺血/再灌注損傷具有保護作用。

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