WRKY轉錄因子在防御反應中的信號轉導網絡及其功能研究概況

王春玲，徐祥彬，潘園園，應奇才，王慧中

(杭州師范大學 生命與環境科學學院，浙江 杭州 310036)

在長期的進化中，植物形成了一系列抵御生物和非生物脅迫逆境的防衛反應機制。WRKY家族是近年來發現的植物特有的一類轉錄因子家族，在防衛反應中起到了重要的調節作用。WRKY家族最顯著的特點是至少含有一段大約60個氨基酸的WRKY結構域，在其N端有保守的WRKYGQK序列，在C末端有一個鋅指結構:C2-H2或 C2-HC。根據WRKY結構域的數量和鋅指結構的組成可以將WRKY家族分為3類。Ⅰ類有2個WRKY結構域，且有C2-H2的鋅指結構。Ⅱ類只有1個WRKY結構域，鋅指結構與Ⅰ類相同，大多數發現的WRKY因子屬于這一類。Ⅲ類也只有一個WRKY結構域，但鋅指結構為C2-HC。當植物受到病原菌和SA等因子的誘導后，WRKY轉錄因子就會迅速表達積累，并與抗病相關基因上的 (T) (T)TGAC(C/T)序列 (W-box)特異性結合，從而啟動防御，形成了一個復雜的WRKY調控網絡。

1 植物天然免疫系統

植物先天性免疫系統包括相互關聯的2個分支，即病原相關分子模式 (PAMP)激發的免疫反應 (PAMP-triggeredimmunity，PTI)和效應子(effector)激發的免疫反應 (effector-triggered immunity，ETI)，這2種免疫啟動了高通量的轉錄重組。PAMPs是指病原微生物上有共同特征的分子，如鞭毛素、糖蛋白、脂多糖等，它能與植物細胞表面受體相識別，激活下游不同的信號途徑，產生免疫反應。許多微生物分泌的有毒的effector進入宿主細胞，植物抗病蛋白 (R蛋白)能與其專一性識別進一步激活了防御反應。在擬南芥和其他高級植物中，PTI和ETI途徑受不同防御反應途徑調控，包括水楊酸 (SA)和茉莉酸 (JA)等激素信號網絡所介導的抗病防御反應途徑［1］。

大多數病原體激發了一個常規的相互聯系的植物信號轉導網絡。WRKY轉錄因子家族參與了植物的免疫反應，是轉錄調控和抗病防御反應的關鍵調控子［2－3］。在擬南芥中，大量協同調控的防御基因啟動子上WRKY轉錄因子結合位點 (C/TTGACC/T，W盒)的存在，為鋅指型 WRKY轉錄因子在調控防御反應過程中起到廣泛而重要的作用提供了旁證。

2 WRKY轉錄因子在植物防御反應中的作用

WRKY轉錄因子是植物中最大的轉錄調控子家族之一，是抗病防御反應的關鍵調控子，防衛反應信號傳遞網絡的重要組成部分［4］。AtWRKY70的功能缺失易遭受Erysiphe cichoracearum和Botrytis cinerea等真菌類的侵害，遭受Erwinia carotovora和Pseudomomonassyringae等細菌類的侵害。AtWRKY70是基礎防御反應和完整的R基因介導的抗病反應，以抵抗Hyaloperonospora卵菌疫病侵襲所必需的調控因子［5－6］。AtWRKY52/RRS1 賦予擬南芥對Ralstonia solanacearum的抗性，但編碼的蛋白質可作一種R蛋白［7］。AtWRKY33的突變使擬南芥更易遭受B．cinerea和Alternaria brassicicola感染［8］。WRKY可作負調控子，在AtWRKY7和AtWRKY11/AtWRKY17突變體中，受有毒P．syringae菌株激發的植物基礎抗性免疫反應加強［6］。

AtWRKY18，AtWRKY40和AtWRKY60在調控植物抗病反應過程中具有重要的功能。Xu等［9］發現AtWRKY18/AtWRKY40和AtWRKY18/AtWRKY60的雙突變體更耐P．syringaeDC3000的侵襲，但更易感染B．cinerea，AtWRKY18/AtWRKY40雙突變體也高效的抵抗有毒粉狀霉菌Golovinomyces orontii。這些結果表明在植物防御反應中WRKY因子有著正調控和負調控的作用。與此相一致，AtWRKY18單獨過量表達導致了植物對P．syringae基礎免疫反應的加強，而AtWRKY18與其他ⅡaWRKY成員一起過量表達與此結果完全相反。有2個WRKY因子 (AtWRKY53和AtWRKY58)已被確定為SAR的調控子，其中 AtWRKY53為正調控子，AtWRKY58 為 負 調 控 子［10］。在 擬 南 芥 中，將AtWRKY48的T-DNA插入突變體和過量表達植株感染細菌病原體P．syringae，結果發現在插入突變體中，SA調控的PR1的誘導表達增加，提高了植物的抗病性，而在過表達植株中，由于PR基因表達減少，增強了P．syringae的生長和對該病原菌的敏感性。因此，對于PR基因的表達和對P．syringae的基礎抗性來說，AtWRKY48是一個負調控因子［11］。AtWRKY3和 AtWRKY4對壞死營養型病原體抗性反應起積極作用，而在抗活體營養型病原體時，WRKY4對其產生消極作用［12］。

水稻WRKY轉錄因子在抗病防御反應中發揮著重要作用。如OsWRKY53和OsWRKY71的過量表達能夠促進防御反應相關基因，包括病原相關蛋白基因如PBZ1的表達，并且增強了水稻對Magnaporthe grisea的抗性，表明水稻OsWRKY53/71在誘導子誘導的防御信號途徑中起著重要作用。水稻Xa21基因賦予水稻對Xanthomonas oryzae pv．oryzae(Xoo)的抗性，轉錄因子OsWRKY62因子能與Xa21相結合并表達2種蛋白質，分別是OsWRKY62.1和 OsWRKY62.2。在轉基因植物中過量表達OsWRKY62.1就會消弱植物基礎防御反應，而過量表達OsWRKY62.2就會抑制防御相關基因的表達激活，因此在水稻自然免疫中OsWRKY62作為一個負調控子，為水稻基礎防御反應和特異防御反應的關鍵介導子［13］。在SA介導的防御信號體系中，WRKY45起正調控作用，能提高水稻的抗病性。OsWRKY31基因的過量表達能增強水稻抗M．grisea的感染，同時引起下游防御相關基因如PBZ1等的組成型表達，可能是生長素效應和防御反應信號轉換途徑的一個作用元件［14］。

3 WRKY轉錄因子保守的結構序列及防御作用

WRKY轉錄因子除了WRKY結構域的核心序列之外還有一些保守的結構特點。這些結構很可能功能性地將單個的WRKY分子彼此連接起來或者將單個的WRKY分子與另外的防御性信號元件連接起來。WRKY25和WRKY33因子的D motif是保守的，能通過核定位的耦合因子MKS1介導而被MPK4磷酸化，MPK4是一種抑制水楊酸信號途徑的MAP激酶，這種保守的D motif存在于許多Ⅰ類WRKY轉錄因子的N末端。D motif的一個顯著特點是有一個保守的Ser-Pro二聚體分子模式，它是受MAP激酶磷酸化的優先位點。煙草Ⅰ類WRKY因子，含有D motif的NtWRKY1因子能被SIPK因子磷酸化［15］。在體外，SIPK介導的磷酸化能增強W盒與NtWRKY1的結合活性，SIPK與NtWRKY1的協同表達導致植物快速的過敏反應。

擬南芥Ⅱa WRKY蛋白的N端亮氨酸拉鏈基序介導這種類型成員之間的同源二聚化或異源二聚化。在體外Ⅱa代表成員:水稻的OsWRKY71，大麥的HvWRKY1和HvWRKY2被發現能夠進行同源性連接［16］。環境條件，突變體，或者過量表達引起的集中干擾能夠影響不同ⅡaWRKY二聚體之間的平衡，因此改變了植物體-病原體互作的結果。

在Ⅱd WRKY成員中發現保守的Cmotif，構成一個鈣調蛋白結合域，能感知病原體引發的細胞內Ca2+水平的波動并作出反應。還有獨立于 WRKY區域的鋅簇，其嚴格保守的殘基序能加強WRKY因子與 DNA的親和力。AtWRKY7和 AtWRKY11作為轉錄抑制子與其保守結構特點密切相關［17］。

4 WRKY網絡存在的證據

植物免疫反應與大量不同的WRKY轉錄體和蛋白質協同一致的調節相聯系。在擬南芥中，SA依賴的防御反應一旦激發，至少有49個AtWRKY基因表現了差異表達［6］。利用擬南芥突變體研究發現，WRKY基因能積極或消極的影響其他基因家族成員的表達［18］。水稻在非生物脅迫和激素處理條件下，有54個WRKY基因在轉錄水平上表現了極大的不同，其中有28個基因受這2種處理方式調控，表明在非生物脅迫和激素信號途徑之間也有WRKY因子相互作用［19］。在油菜中，大量的BnWRKY蛋白參與了真菌病原體和激素刺激引起的防御反應相關基因的轉錄調控［20］。以上說明，WRKY基因通過自主調控和交叉調控機制來進行功能性的連接，它們形成了基因轉錄網絡的核心，這個網絡伴隨著其它信號元件，控制大量的抗病基因。此外，這個WRKY網絡由正調控和負調控元件構成，這些元件能讓防御信號有效且不失均衡的擴增和多樣化［6］。

5 WRKY因子構成的信號轉導網絡

病原菌上的PAMP與PRR的識別激發了細胞防御信號，引發了 MAPK級聯反應［21］。經過不同的蛋白激酶磷酸化反應，含有 D motif的Ⅰ類WRKY因子首先被蛋白激酶MPK4磷酸化，激活的WRKY因子一方面調節SA和JA依賴的免疫反應之間的平衡，另一方面WRKY因子也與自身的W盒結合，從而促進抗病基因的表達，進行防御反應。病原誘導性的ICS1基因的表達激發了SA的產生，ICS1基因可能是WRKY因子的一個靶基因，因為ICS1的啟動子有豐富的W盒。SA的產生使細胞質內低聚化的NPR1解聚，NPR1進入細胞核內。對于NPR1，一部分WRKY轉錄因子是它的轉錄靶目標，同時其本身也受WRKY因子調節表達。像8種WRKY基因 (AtWRKY18，－38，－53，－54， －58， －59， －66和 －70)都是 NPR1的靶基因，NPR1與TGA轉錄因子在基因的啟動子位點相互作用，促進這些WRKY因子的表達，進一步啟動下游抗病基因的表達，其中WRKY70能促進SA依賴的抗病基因的表達，抑制JA依賴性的抗病基因的表達。病原菌分泌的效應子如AVR一旦進入細胞便迅速與抗性蛋白 (R蛋白)識別，激活的R蛋白激發了ETI途徑，最終獲得抗病性。同時效應子與一些WRKY因子相互作用，進一步抑制了PAMP依賴的基礎免疫反應，這種負反饋機制似乎提供了PTI與ETI之間的功能型接口［16］，與 PTI相比，ETI對病原菌防御反應更快，作用更強。

作為對PAMP處理的反應，PcWRKY1轉錄體快速的積累，AtWRKY33和 OsWRKY53能夠被相關刺激激活并參與防御反應，這種快速的反應是通過3種協同作用的W盒的保守排列介導的［22］。通過免疫沉淀反應和基因組微陣列，AtWRKY51被確定作為一個潛在的SA依賴性的TGA2的下游靶蛋白［23］。擬南芥AtWRKY62能夠被 SA和 MeJA 2種物質協同誘導表達，AtWRKY62的基因敲除突變體和過量表達植株顯示，AtWRKY62能啟動下游NPR1的表達，而NPR1能夠促進SA免疫途徑并抑制JA途徑［24］。對 T-DNA插入突變體中和轉基因過表達株系進行分析，WRKY25是P．syringae引起的SA介導的防御反應的一個負調控子［25］。熱脅迫誘導的AtWRKY39能調控SA和JA信號途徑之間的協同作用，提高了擬南芥的耐熱性，AtWRKY25 在耐熱性方面也發揮了作用［26－27］。可見WRKY轉錄因子在PAMP激發轉錄級聯反應的不同層次進行工作，并與 ETI激發途徑，SA、JA等獲得性免疫途徑有著密切聯系，表明WRKY網絡具有復雜和廣泛性特點。

6 WRKY轉錄因子的功能多樣性

WRKY家族在非生物脅迫，衰老，損傷等方面也具有不同的調控作用。WRKY75是第一個被報道的參與營養物質匱乏調控和根生長發育的WRKY轉錄因子。WRKY3和WRKY6調控植物響應植食性昆蟲對植物造成的損傷。WRKY34是花粉特異性的轉錄因子，對于冷脅迫下花粉的生長發育和成熟具有重要調控作用［28］。OsWRKY80是在水稻中發現的由于Fe過量而誘導產生的脅迫應答基因［29］。OsWRKY72能夠干擾ABA信號和生長素運輸途徑之間的相互作用［30］。OsWRKY08獨立于ABA信號途徑能提高擬南芥的滲透脅迫耐受性［31］。NtWRKY4參與了煙草葉子形態的構建及抗病毒 (TMV)防御反應。可見，WRKY因子參與了植物許多生理過程，隨著研究深入，WRKY因子的其他功能也會被發現。

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