阿爾茨海默病的免疫治療研究進展

羅 強 王永紅 (重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶 400016)

阿爾茨海默病(AD)是老年人常見的神經系統變性疾病，主要以記憶力減退、認知功能障礙、精神行為異常為臨床特征;以細胞外老年斑和神經元內神經纖維纏結為病理特征。老年斑的中央核心是Aβ，神經纖維纏結是由異常磷酸化Tau蛋白產生的雙股螺旋纖維所組成。現普遍認為“淀粉樣級聯假說”在AD發病機制中占重要地位，其認為Aβ在啟動AD級聯反應方面處于中心地位，是AD形成和發展的關鍵因素，是AD的共同通路〔1〕。Tau蛋白與微管結合，在維持細胞及細胞器形態和功能方面至關重要。所以，通過免疫方式減少腦內Aβ和過度磷酸化的Tau蛋白沉積，就能阻礙AD發生發展。

1 Aβ相關免疫

1.1 Aβ簡介 Aβ前體蛋白(APP)是整合跨膜蛋白，目前認為APP切割主要分為非淀粉樣蛋白和淀粉樣蛋白兩種途徑。后者先由β分泌酶產生含99個羧基末端片段的C99并留于膜內，再由Y分泌酶水解產生Aβ40和少量Aβ42，他們是由40和42個氨基酸組成的多肽，后者的羧基末端多2個疏水氨基酸，使其更容易集聚，尤其是低聚狀態具有突觸和神經毒性〔2〕。

1.2 主動免疫 主動免疫是用Aβ多肽疫苗，刺激機體發生免疫應答，產生抗Aβ抗體，促進Aβ清除。1999年Schenk〔3〕等首次用Aβ疫苗(AN－1792)治療過度表達Aβ的老鼠時，發現其有效性。然后再對轉基因老鼠進行免疫，發現能降低大腦中Aβ數量并改善認知功能〔4〕。另一研究是用聚集的Aβ1－42或者胰島淀粉樣多肽和完全弗氏佐劑免疫恒河猴，前者治療使得血漿中增加了5% ～10%的抗體滴度，但這些猴子大腦中的Aβ數量并沒有減少。AN－1792疫苗用于Ⅱ期臨床試驗時部分患者出現亞急性腦膜腦炎而終止，其中2例病例在尸檢時確實發現Aβ和Tau蛋白數量有所下降。然而，認知功能在總體研究人群中并沒有提高〔5〕。

目前進入臨床試驗的還有CAD－106疫苗，其能夠降低動物中Aβ數量，且在早期人體試驗中不發生腦膜腦炎〔6〕。另外一些短肽分子疫苗，如 ACC－001，ACI－24，UB－311，V－950 等已經在早期臨床研究之中。

Ferrer等〔7，8〕認為主動免疫時出現腦膜腦炎可能是由于 T細胞介導的。研究發現全長的 Aβ1－42可誘導 T淋巴細胞炎癥反應，進一步將Aβ16～33位點進行部分替換后，其誘導 T細胞的免疫反應降低，從而證實Aβ16～33位點是T淋巴細胞反應的主要表位;Aβ1～15位點是誘導B細胞免疫的主要位點，其中Aβ3～6位點殘基可能是影響Aβ溶解或沉積的主要位點，而Aβ25～35位點可能是Aβ細胞毒作用的核心片段。通過疫苗表位的設計，可以誘生更多結構相同的Aβ抗體，從而增強免疫反應并避免T細胞免疫所致腦膜腦炎。胡金家〔9〕等AD免疫治療課題組成功制備Aβ1～15多肽疫苗，其能誘導野生型鼠及轉基因鼠及猴產生高滴度的抗Aβ抗體，并使轉基因鼠的認知功能明顯提高，且在體外試驗時能抑制Aβ42的細胞毒性作用。

1.3 被動免疫

1.3.1 被動免疫動物試驗 被動免疫是將體外產生的抗Aβ單克隆抗體應用于AD模型或患者體內，促進大腦內Aβ轉移或清除。Solomon等〔10〕發現在體外試驗中抗Aβ抗體能溶解聚集的Aβ并能抑制聚集的Aβ所修飾的神經細胞毒性。Bard等〔11〕給轉基因鼠體內注射不同Aβ抗原決定簇的單克隆抗體，發現用 IgG2b Aβ1～15及 IgG1Aβ3～7被動免疫的鼠大腦 Aβ 沉積明顯減少并提高了認知能力，而用Aβ33～42抗原決定簇的單克隆抗體免疫的個體沒有效果。但在2004年，Wilcock等〔12〕用2286(Aβ28－40)免疫Tg2576老鼠3個月后，提高了認知能力并減少了彌散型及緊密型Aβ沉積，還發現短暫而明顯的小膠質細胞活化。

1.3.2 被動免疫臨床藥物進展 Bapineuzumab(AAB－001)是人工合成的針對Aβ N－末端單克隆抗體，在一次試驗中，發現皮層Aβ有所減少〔13〕。有趣的是，Bapineuzumab似乎對沒有載脂蛋白E(ApoE)ε4等位基因的個體的認知功能有益，但這些結果并無顯著差異〔13〕。Solanezumab(LY2062430)是一種針對Aβ13～28片段的單克隆抗體。Bapineuzumab作用于沉積的淀粉樣蛋白斑塊，而Solanezumab作用于可溶性Aβ且能夠使Aβ從體內清除。早期研究提示Solanezumab減少老年斑中Aβ數量〔14〕。Ponezumab(PF－04360365)是一種作用于 Aβ1～40自由羧基端的抗體，正在進行的初步人體試驗提示其能增加腦脊液中Aβ。單克隆抗體早期階段的研發還包括 GSK－933776，Gantenerumab(R－1450)，MABT－5102A，免疫球蛋白 G2 抗體等。

1.3.3 被動免疫的缺點 生產單克隆抗體花費巨大，且需要反復多次注射，難以選擇合適靶點，難以透過血腦脊液屏障(BBB)，出血風險，針對抗體的免疫反應。Wilcock等〔12〕也發現被動免疫轉基因鼠使微出血顯著增加。Bapineuzumab最嚴重的副作用是大腦血管源性水腫〔13〕，幾乎出現在10%的治療者中。這可能與大劑量藥物和含ApoE基因相關，但ApoE基因是AD病人的危險因素。但用m266(Aβ中心區域的單克隆抗體)被動免疫并未增加老鼠大腦微出血，卻仍能明顯減少Aβ斑塊樣病理改變和提高認知功能。血管淀粉樣病變及微出血在去糖基化IgG2b抗體(de－2H6)免疫鼠中減少，可能因為去糖基化的抗體減弱了其與Fc受體的親和力〔15〕。

1.3.4 被動免疫新方法 靜脈注射含抗Aβ抗體的天然免疫球蛋白，發現可以干預Aβ的低聚反應及纖維化，還能保護神經元免受Aβ多肽的毒性，加快Aβ多肽從大腦中的清除，意味著靜脈注射免疫球蛋白(IVIg)治療可能是一種新的被動免疫方法〔16〕。一些臨床試驗〔17〕發現抗 Aβ抗體能透過 BBB并影響Aβ水平且對AD患者有臨床效果，但這些試驗僅僅在很少部分病人中進行，大型Ⅲ期臨床試驗正在進行中。

1.4 基因免疫 基因免疫的基本原理是用含Aβ基因的載體免疫轉基因鼠，通過轉基因鼠表達Aβ，誘生抗Aβ抗體，從而促進Aβ從大腦中清除。DNA疫苗相對簡單、易修飾、不需要佐劑，免疫反應容易向Th2細胞方向調控。最初，AβDNA疫苗由腺病毒或腺相關病毒載體編碼。目前研究者關注非病毒質粒載體，因為其可以大規模低成本生產并且沒有被感染或轉染的風險。通過設計編碼Aβ B細胞抗原決定簇基因疫苗位點，能誘生抗Aβ抗體的同時而不誘導T細胞反應。但短肽Aβ免疫原性弱，可通過多次拷貝Aβ抗原決定簇的方式來增加免疫原性。Movsesyan等〔18〕研發了一種更短的DNA表位疫苗，其包含3 次拷貝 Aβ1～11，再去免疫 3 × Tg－AD(編碼突變 APP、PS1、Tau蛋白)鼠，Aβ病理改變及膠質細胞活化減弱，認知功能惡化有所改善，且未見微出血現象。Okura等〔19〕用非病毒Aβ疫苗免疫APP23轉基因鼠，分成Aβ沉積前后兩組，即預防組和治療組，預防組腦中Aβ負荷減少，治療組負荷降低約50%。

2 磷酸化Tau蛋白免疫靶點

2.1 Tau蛋白的基因、結構、功能 人類神經Tau蛋白基因定位于17q21，編碼6種分子結構的tau蛋白，其結構差異在于N端有0～2個插入子，C端有3～4個串聯重復單元，其中具有4個重復單元的Tau蛋白與微管結合能力更強，可促進微管組裝，并參與軸突運輸，N末端結構域與其他細胞骨架成分和細胞膜結合，維持軸突穩定。異常磷酸化的Tau蛋白在細胞內聚集形成雙股螺旋狀纖維絲(PHF)，許多PHF互相纏繞進一步形成神經纖維纏結(NFTs)，并使Tau蛋白及其他微管相關蛋白從微管中釋放出來，導致細胞骨架異常，軸漿運輸障礙。

2.2 Tau蛋白免疫 目前，已經證明用磷酸化tau蛋白〔20〕主動免疫轉基因老鼠P301L持續2～5個月后，組織和生化分析提示其能夠阻斷tau蛋白相關病理改變并能提高執行能力。抗體如何對集聚在細胞內蛋白質起積極作用，至今不甚清楚。然而，此結果得到了另外一項研究的支持——用α突觸核蛋白免疫的PD轉基因老鼠模型，細胞內的α突觸核蛋白集聚減少〔21〕。最近，在組織培養模型中研究證明:細胞外的tau蛋白聚集物能夠被陷入細胞內并且促進tau蛋白纖維化。這種異常構象蛋白質的傳染性就像阮蛋白〔22〕。

綜上，根據AD的病因、病理機制等，目前已經涌現出多種治療策略，但許多藥物的療效都有待于大量臨床試驗證實。AD的免疫治療既拓寬了藥物治療范圍，更有助于深入理解AD的病理機制，其治療的關鍵是降低Aβ及Tau蛋白的同時又能改善患者臨床癥狀并且達到安全的目的。雖然，近幾年在AD的動物試驗及臨床試驗中取得了一些進展，但仍存在許多問題，如主動免疫時高選擇性疫苗制備，被動免疫時較弱免疫原性抗體的制備，基因免疫時強免疫原性的DNA疫苗表位，特異性位點的磷酸化Tau蛋白抗體制備等。“聯合治療”，可能是一種新的治療方案，即免疫治療的同時應用多種途徑減少Aβ的生成和增加Aβ清除，減輕Tau的聚集，減輕臨床癥狀。如積極的抗炎、抗氧化、調節脂代謝、膽堿能受體激動劑、抗膽堿酯酶、抑制分泌酶等等。

1 Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease:progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science，2002;297(5580):353－6.

2 Esler WP，Wolfe MS.A portrait of Alzheimer secretases－new features and familiar faces〔J〕.Science，2001;293(5534):1449－54.

3 Schenk D，Barbour R，Dunn W，et al.Immunization with amyloid－beta attenuates Alzheimer－disease－like pathology in the PDAPP mouse〔J〕.Nature，1999;400(6740):173－7.

4 Morgan D，Diamond DM，Gottschall PE，et al.A beta peptide vaccination prevents memory loss in an animal model of Alzheimer′s disease〔J〕.Nature，2000;408(6815):982－5.

5 Gilman S，Koller M，Black RS，et al.Clinical effects of Abeta immunization(AN1792)in patients with AD in an interrupted trial〔J〕.Neurology，2005;64(9):1553－62.

6 Winblad BG，Minthon L，Floesser A，et al.Results of the first－in－man study with the active Abeta immunotherapy CAD106 in Alzheimer patients〔J〕.Alzheimer Dement，2009;5(4suppl1):113－4.

7 Ferrer I，Rovira MB，Guerra MLS，et al.Neuropathology and pathogenesis of encephalitis following amyloid－beta immunization in Alzheimer′s disease〔J〕.Brain Pathol，2004;14(1):11－20.

8 Frenkel D，Fewachter I，Van Leuven F，et al.Reduction of beta amyloid plaques in brain of transgenic mouse model of Alzheimer′s disease by EFRH－phage immunization〔J〕.Vaccine，2003;21(11－12):1060－5.

9 胡金家，李國營，汪華僑，等.淀粉樣β蛋白42及其亞單位疫苗預防接種對APPSWE轉基因小鼠學習記憶能力的保護作用〔J〕.中國臨床康復，2005;9(13):185－7.

10 Solomon B，Koppel R，Frankel D，et al.Disaggregation of Alzheimer beta－amyloid by site－directed mAb〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997;94(8):4109.

11 Bard F，Cannon C，Barbour R，et al.Peripherally administered antibodies against amyloid beta－peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease〔J〕.Nat Med，2000;6(8):916－9.

12 Wilcock DM，Rojiani A，RosenthalA，et al.Passive immunotherapy against Abeta in aged APP－transgenic mice reverses cognitive deficits and depletes parenchymal amyloid deposits in spite of increased vascular amyloid and microhemorrhage〔J〕.J Neuroinflammation，2004;1(1):24.

13 Rinne JO，Brooks DJ，Rossor MN，et al.11C－PiB PET assessment of change in fibrillar amyloid－beta load in patients with Alzheimer′s disease treated with bapineuzumab:a phase 2，double－blind，placebo－controlled，ascending－dose study〔J〕.Lancet Neurol，2010;9(4):363－72.

14 Siemers ER，Friedrich S，Dean RA，et al.Safety and changes in plasma and cerebrospinal fluid amyloid beta after a single administration of an amyloid beta monoclonal antibody in subjects with Alzheimer disease〔J〕.Clin Neuropharmacol，2010;33(2):67－73.

15 Wilcock DM，Alamed J，Gottschall PE，et al.Deglycosylated anti－amyloid－beta antibodies eliminate cognitive deficits and reduce parenchymal amyloid with minimal vascular consequences in aged amyloid precursor protein transgenic mice〔J〕.J Neruosci，2006;26(20):5340－6.

16 Istrin G，Bosis E，Solomon B.Intravenous immunoglobulin enhances the clearance of fibrillar amyloid－beta peptide〔J〕.J Neruosci Res，2006;84(2):434－43.

17 Foster JK，Verdile G，Bates KA，et al.Immunization in Alzheimer′s disease:naive hope or realistic clinical potential〔J〕?Mol Psychiatry，2009;14(3):239－51.

18 Movsesyan N，Ghochikyan A，Mkrtichyan M，et al.Reducing AD－like pathology in 3xTg－AD mouse model by DNA epitope vaccine－a novel immunotherapeutic strategy〔J〕.PLOS ONE，2008;3(5):2124.

19 Okura Y，Miyakoshi A，Kohyama K，et al.Nonviral Abeta DNA vaccine therapy against Alzheimer′s disease:long－term effects and safety〔J〕.Procnati Acad sci USA，2006;103(25):9619－24.

20 Asuni AA，Boutajangout A，Quartermain D，et al.Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements〔J〕.J Neurosci，2007;27:9115－29.

21 Masliah E，Hansen L，Adame A，et al.Aβ vaccination effects on plaque pathology in the absence of encephalitis in Alzheimer disease〔J〕.Neurology，2005;64:129－31.

22 Aguzzi A.Cell biology:beyond the prion principle〔J〕.Nature，2009;459:924－5.