胚胎干細胞誘導成神經細胞的研究進展

秦厲梅 劉黎青 周盛年 王 媛 (山東中醫藥大學，山東 濟南 50355)

帕金森病、阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化病、脊髓損傷、腦外傷、腦卒中等均由于分化成熟的神經細胞不能分裂增殖，無法彌補損傷或死亡的細胞。這些疾病的病理表現無一例外都涉及神經細胞的丟失，且丟失的細胞得不到新生細胞的補充，故治療這些疾病的最佳途徑就是誘導多能性干細胞分化形成各種類型的神經細胞，然后進行細胞移植治療，以替代那些丟失的細胞，使神經功能恢復。1998年Thomson等和Gearhart各自成功建立了人的胚胎干細胞(ESC)系，使人們看到了用ESC治療人類疑難疾病的曙光。自從建系以來，ESC的研究領域取得了不少可喜的成績。目前大部分ESC體外誘導分化的細胞類型主要集中在心肌細胞、肌細胞、內皮細胞、造血細胞和神經細胞等，而ESC的神經誘導分化一直是干細胞研究領域的熱點〔1〕，故本文將近年來ESC向神經細胞誘導分化的研究進行綜述。

1 ESC的來源及特性

ESC是來源于著床前囊胚期的內細胞團(inner cellmass，ICM)或早期胚胎原始生殖嵴的原始生殖細胞(primordialgerm cell，PGC)的一種多潛能細胞，具有體外無限增生和高度自我更新能力的兩個顯著特征〔2〕。

形態學上，ESC具有與早期ESC相似的形態結構，細胞核大，有一個或幾個核仁，胞核中多為常染色質，胞質少，結構簡單。體外培養時，細胞排列緊密，呈集落狀生長。用堿性磷酸酶染色，ESC呈棕紅色，而周圍的成纖維細胞呈淡黃色。細胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細胞彼此界限不清，細胞表面有折光較強的脂狀小滴。細胞克隆形態多樣，多數呈島狀或巢狀。

ESC系的特征包括:①能大量繁殖并保持未分化狀態;②在一定條件下具有向3個胚層組織和細胞分化的全能性;③能夠形成嵌合體動物，即ESC具有種系傳遞功能;④易于進行基因改造操作〔3〕。

2 ESC向神經細胞的誘導分化

2.1 ESC體內向神經細胞的分化 ESC植入機體后的分化方向受局部微環境的影響較大。將維甲酸(RA)誘導后的小鼠B5 ESC植入視網膜變性的rd1小鼠的玻璃體，6 w后可觀察到植入細胞已經整合到視網膜內層，達到與視網膜的神經細胞組成一致的情況:大多數分化為神經元，少量為星形膠質細胞，并且沒有少突膠質細胞形成〔4〕。將用RA特定處理的ESC移植到脫髓鞘模型的大鼠背側脊髓，一段時間后發現大量的ESC存活并且在髓鞘部位分化為少突膠質細胞，形成髓鞘〔5〕。

2.2 ESC體外向神經細胞的分化

2.2.1 RA誘導 RA在ESC誘導分化過程中起了非常關鍵的作用。RA誘導的細胞表現了多種神經細胞特征。在經過4 d的RA誘導后，ESC出現了神經樣細胞:細胞胞體小，并有一些長的突起。單抗染色細胞表達了神經微絲的M亞單位及Ⅲ型β－微管蛋白。與神經功能密切相關的蛋白基因也在誘導后表達上調，如神經遞質合成酶(GAD和TH)、遞質受體亞單位(GluRs)和細胞骨架亞單位(NF－1)。電生理也顯示了細胞具有與神經遞質功能性受體有關的電壓控制的Na+、K+、Ca2+的離子通道〔6〕。

2.2.2 基質細胞源性誘導法(SDIA) SDIA可將小鼠ESC向神經細胞誘導分化。將小鼠的ESC與骨髓來源的基質細胞(PA6)放在一起共同培養1 w，90%以上的ESC可被誘導分化為神經前體細胞和神經元〔7，8〕。SDIA法不但操作起來簡單，而且其中的神經分化快速有效，經SDIA處理的小鼠ESC可分化為含量高達30%的中腦多巴胺能神經元，將其植入小鼠體內后不僅可以存活，還能與宿主細胞建立神經網絡〔9〕。

2.2.3 生長因子誘導 在ESC體外培養的培養基中加入特定的生長因子后，能促進ESC向特定神經細胞分化，如白血病抑制因子(LIF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、成纖維生長因子－2(FGF－2)、表皮生長因子(EGF)、血小板源性生長因子(PDGF)和胰島素等〔10，11〕。卵磷脂－腦源性神經生長因子(PCBDNF)比BDNF對神經前體細胞有更好的親和力，它可以通過加強 TrkB受體表達，提高 Mash－1、p35、NF68的表達，從而促進神經的分化〔12〕。

2.2.4 應用譜系限制性發育控制基因控制ESC向神經分化

譜系選擇就是用某種神經干細胞所含的基因轉染ESC，選擇性的剔除不含譜系限制性基因的細胞，通過促進特定基因表達來獲得純的細胞系。在ESC體外培養的早期即可有效快速誘導神經細胞分化，其作用強于RA。

核受體相關因子－1(Nurr1)是基因轉錄因子的一種，其可促進中腦神經前體細胞分化為多巴胺能神經元。將全長的大鼠Nurr1 cDNA克隆到質粒中，再將小鼠ESC轉染，使得分化細胞TH陽性率從5%上升到50%〔13〕。

2.2.5 中藥誘導 有研究證明經典補益中藥淫羊藿(Herba Epimedii)誘導ESC分化為神經干細胞的過程中，采用Western印跡法對神經細胞特異性蛋白膽堿乙酰基轉移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)、神經元特異性骨架蛋白 β－TublinⅢ進行檢測。結果顯示，隨著ESC的分化發育，ChAT、β－TublinⅢ的表達呈逐漸增加的趨勢。β－TublinⅢ在懸浮培養至第8天的擬胚體中表達明顯增加，貼壁分化5 d后，表達量繼續增加，后趨于穩定;膽堿能神經標志蛋白ChAT則在貼壁分化5 d后明顯增加，后趨于穩定。這些證據提示了神經細胞發育的時間依賴性，貼壁分化的前5 d是藥物誘導ESC分化為神經細胞的關鍵時間窗。淫羊藿素(icaritin，ICT)處理組細胞ChAT蛋白表達量比溶劑對照組高，提示ESC能夠分化發育為膽堿能神經，ICT對此過程具有一定的促進作用。

淫羊藿的主要成分淫羊藿苷(icaritin，ICA)為異戊烯基黃酮苷類化合物，其在體內的代謝組分為淫羊藿素(ICT)和去甲淫羊藿素(desicaritin，DICT)，ICT具有促進ESC體外定向分化為神經細胞的作用，ICT引起的p38的低磷酸化水平是ICT誘導ESC分化為神經細胞的可能機制〔14〕。

3 ESC的研究前景

近年來ESC來源的細胞在移植領域的研究逐漸成為一個焦點。ESC誘導形成的神經細胞可作為細胞移植的最佳對象。隨著社會老齡化的到來，神經系統退化性疾病在人類疾病中的比重越來越大。通常認為，神經細胞不可再生，故以往的研究基本都集中在改善神經系統損害癥狀并防止進一步損害的治療方法上。ESC能夠成功誘導分化為神經細胞的，為神經系統疾病的治療打開了嶄新的一頁。但此技術如果應用到臨床上，其所需要的細胞來源必須具備:供體細胞來源豐富，安全可靠，純度較高，移植的細胞能產生所需的神經譜系細胞，且不產生免疫排斥等條件〔15〕。

添加誘導劑RA后的神經誘導效率很高，可達90%以上，但是誘導后的細胞成分不純，雜細胞太多，存在的神經細胞大多是神經元與神經膠質細胞，并且神經元所占的比例不大。SDIA雖然操作簡單，神經分化也快速有效，但在機體應用卻不太方便。生長因子造價高，費用昂貴，不適宜大規模的推廣應用。應用譜系限制性發育控制基因控制ESC向神經細胞分化的方法則要求必須將基因插入到基因組的正確位置和分化的恰當階段活化，才能獲得想要的結果。并且由于人為地介入基因組可能導致基因組的不穩定，從而導致下游基因的異常表達。

利用中藥誘導ESC向神經細胞分化具有操作簡單，價格低廉等優點，具有廣闊的應用前景，但中藥誘導出的神經細胞是不是具有神經細胞所具有的完整的功能，是否可完全替代機體的細胞等問題，都有待進一步的研究和探討。中醫藥博大精深，中藥制劑尤其是中藥湯劑或提取液進行誘導的實驗還并不普遍，如果加強這方面的研究，必將取得可喜的成績。相信ESC誘導形成神經細胞的應用前景是不可估量的，它必將在臨床應用中發揮巨大作用。

1 袁 丁.3種培養體系下人胚胎干細胞神經誘導分化的比較〔J〕.西北農林科技大學學報(自然科學版)，2010;38(4):31－6.

2 李英博.體外誘導人胚胎干細胞向神經細胞分化的研究進展〔J〕.神經解剖學雜志，2004;20(6):633－6.

3 劉建中.胚胎干細胞體外誘導分化的研究進展〔J〕.研究進展，2007;4(18):8－9.

4 Meyer JS，Katz MI，Maruniak JA，et al.Neural differentation of mouse embryonic stem cells in vitro and after transplantation into eyes of mutant mice with rapid retinal degeneration〔J〕.Brain Ras，2004;1014(1):131－44.

5 Liu S，Qu Y，Stewart TJ，et al.Embryonic stem cells differentiation into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(11):6126－31.

6 沈 干，叢笑倩.胚胎干細胞向神經細胞誘導分化的研究〔J〕.國外醫學·生物醫學工程分冊，2002;25(4):150－6.

7 Kawasaki H，Suemori H，Mizuseki K，et al.Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cellderived inducing activity〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99(3):1580－5.

8 Wichterle H，Lieberam I，Porter JA，et al.Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons〔J〕.Cell，2002;110(3):385－97.

9 徐海偉，吳 旋.胚胎干細胞向神經細胞分化的研究進展〔J〕.第三軍醫大學學報，2003;25(3):267－9.

10 唐 軍，曹 娟.胚胎干細胞誘導分化為神經細胞治療帕金森病的前瞻于現狀〔J〕. 中國臨床康復，2003;7(25):3503－5.

11 Tropepe V，Hitoshi S，Sirard C，et al.Direct neural fate specification from embryonic stem cells:a primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism〔J〕.Neuron，2001;30(1):65－78.

12 Kitagawa A，Nakayama T，Takenaga M，et al.Lecithinized brain derived neurotrophic factor promotes the differentiation of embryonic stem cells in vitro and in vivo〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;328(4):1051－7.

13 Kim JH，Auerbach JM，Rodriguez－Gomez JA，et al.Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson′s disease〔J〕.Nature，2002;418(4):50－6.

14 王志強.異戊烯基黃酮類雌激素受體調節劑的神經保護和促胚胎干細胞分化為神經細胞的研究〔D〕.浙江大學博士學位論文，2007:2－83.

15 薛亞梅，王 鋒.胚胎干細胞向神經細胞定向誘導分化方法的研究進展〔J〕. 中國畜牧雜志，2005;41(8):58－60.