細胞自噬和缺血性腦卒中

郭 強 韋 強 邊心超 張金柱 王宏磊 (吉林大學白求恩第一醫院神經外科，吉林 長春 130021)

自噬作為Ⅱ型程序性細胞死亡，在腫瘤、老化和神經退化等細胞增殖和死亡紊亂疾病中發揮著重要的作用。近年來，越來越多的學者關注到在缺血性腦卒中不僅有細胞的凋亡和壞死的參與，尚有細胞自噬參與其中。本文就細胞自噬和缺血性腦卒中的研究進展予以綜述。

1 自噬的概念

自噬(autophagy)是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，是生命進化過程中一種保守的細胞行為，也是真核細胞特有的生命現象。自噬參與了細胞對持續性內外刺激的非損傷性應答反應，在維持細胞結構、代謝和功能的平衡方面起重要的作用〔1〕。在細胞的正常生長和分裂中，必然會出現一些不需要的生物大分子和受損、衰老的細胞器，而自噬就參與這些物質的降解和再利用。通常這些待降解物首先被細胞內單層或雙層膜包裹形成自噬體，然后運送到溶酶體形成自噬溶酶體，最后在溶酶體內被多種水解酶水解。

首先，水解生成的氨基酸和脂肪酸可以被用來合成新的蛋白質或參與能量代謝。而該作用在細胞應對各種不利應激的情況下(如營養缺乏、生長因子撤離、輻射等)，尤為重要。通過這種方式細胞可以獲取制造ATP、保證基本代謝過程的營養物質，從而限制其損傷和死亡〔2〕。

其次，通過自噬及時清除多余或損傷的細胞器，對于穩定細胞的形狀和結構，維持細胞的正常功能和避免細胞衰老等至關重要。再次，消滅致病微生物，并參與抗原遞呈過程〔3〕。但是，自噬的過度發生可誘導細胞發生程序性死亡，從而引起一系列疾病過程〔4〕。這種自噬性程序性細胞死亡同凋亡(I型程序性死亡)明顯相異，被學者稱為Ⅱ型程序性死亡〔5〕。

2 細胞自噬的過程

自噬是胞漿大分子物質和細胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學過程。在此過程中自噬體的形成是關鍵。其發生過程大致分為3個階段:

2.1 自噬誘導 在饑餓、氧化應激損傷等情況下，粗面內質網的非核糖體區域、高爾基體等來源的自噬體膜脫落形成杯狀分隔膜，包繞在被降解物周圍〔6，7〕。自噬前體的誘導過程可以是選擇性的，也可以是非選擇性的，分別稱為選擇性自噬和非選擇性自噬，前者是指游離膜結構識別并包裹胞質內的特殊底物形成自噬體，并將其降解，如Cvt途徑(cytoplasm to vacuole targeting pathway)和過氧化酶體降解(pexophagy)途徑;后者是指隨機包裹細胞質形成自噬體。釀酒酵母是選擇性自噬的典型的例子，釀酒酵母細胞質中的Apel蛋白(aminopeptidase 1)通過Cvt途徑直接運輸至雙層膜泡結構〔8〕。選擇性自噬主要由細胞內的底物誘導發生，而非選擇性自噬主要是對細胞外刺激發生反應的結果。在饑餓或生長因子缺乏時可誘導非選擇性自噬的發生。缺氧的信號使mTOR信號途徑失活，從而激活自噬信號途徑。在細胞內信號級聯放大的作用下，Atg相關蛋白被修飾而誘導自噬的發生。

2.2 自噬體形成 分隔膜逐漸延伸，將要被降解的胞漿成分完全包繞形成自噬體。自噬前體誘導形成后，游離膜結構繼續與自噬前體結合，逐漸構成自噬體。在Cvt途徑，游離膜以底物作為支架添加到自噬前體上，使自噬前體逐漸形成自噬體。

非選擇性自噬是依靠Atgl2-At95-Atgl6復合物為支架完成自噬體形成。細胞質內的Atg12、At95和Atgl6被募集到自噬前體的雙層膜結構上，并形成較大的寡聚復合體。此決定雙層膜的曲度，并募集含有At98的游離膜結構，使自噬前體雙層膜結構不斷延長，形成自噬體〔9〕。

2.3 自噬體內容物的降解 自噬體通過細胞骨架微管系統運輸至溶酶體，與之融合形成自噬溶酶體并降解其內成分，自噬體膜脫落再循環利用〔10〕。Atgl2-At95復合物與 Atgl6解聚，At98從自噬體上脫離下來后，自噬體被運輸至溶酶體，其外膜與溶酶體膜融合，自噬體內膜及其內容物進入溶酶體腔。在各種酸性酶的催化下，底物降解為氨基酸、脂肪酸等小分子物質。

調節上述復雜的過程的分子水平有五個關鍵階段〔11〕:(1)形成吞噬泡。(2)At95-12復合物與Atgl6L多聚化。(3)LC3形成并且插入吞噬泡膜。(4)包繞預被降解物。(5)自噬體與溶酶體融合〔12〕。

3 自噬的調控機制

3.1 依賴mTOR(marnmalian target of rapamycin)途徑的自噬

雷帕霉素靶蛋白mTOR，是一種氨基酸、ATP、生長因子、胰島素等分子的感受器，在調節細胞生長，抑制自噬方面起關鍵性作用。酵母中Ser/Thr蛋白激酶Atgl于其他Atg分子結合定位于自噬體前膜上。饑餓刺激下，Atgl3去磷酸化，并與Atgl結合，導致Atgl7依賴性自噬的發生〔13〕。mTOR活性抑制時，促進自噬體形成，在酵母中是通過Atsl和Atgl3去磷酸化而促進下游自噬信號，但在人類中的是否為該機制尚不明了。mTOR活性增強時，通過磷酸化S6KI激活之，進而磷酸化核糖體蛋白S6

(p70s6)來促進mRNA翻譯，同時促使核糖體與內質網的黏附而抑制內質網膜脫落形成自噬體膜。mTOR同時也磷酸化4EBPs并抑制其活性，解除了對真核細胞翻譯啟動因子elF4E的抑制〔14〕。有研究發現在氨基酸豐富時，mTOR信號激活，自噬被抑制，S6K1活性增強，增加了mRNA翻譯、蛋白質合成。氨基酸缺乏時，原料減少，蛋白質合成減少，同時mTOR信號被抑制，自噬增強，S6KI活性減弱，負反饋IRS/Class I PDK的作用減弱，也增強了自噬〔15，16〕。

3.2 依賴磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)途徑的自噬Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class III PI3K)復合物(Atg6-Atgl4-Vpsl5-ClassⅢPI3K)在細胞自噬中扮演重要的角色。它可以將磷脂酰肌醇(PI)磷酸化為3-磷脂酰肌醇(PI3P)，進而募集胞漿中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白質，用于自噬體膜的形成〔17〕。另外抑癌基因Atg6的哺乳動物同源體beclinl和抑癌基因UVRAG作為自噬正調控子，抗凋亡因子bcl-2作為自噬負調控子共同參與組成Class III PI3K復合物調控自噬〔18，19〕。經典的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)并非作用于mTOR途徑，而是通過抑制ClassmPI3K的活性從而抑制自噬形成。

3.3 Ras/PKA通路 有研究證實:哺乳動物和酵母細胞細胞中Ras/PKA通路可感受細胞外葡萄糖含量的變化，并影響到自噬基因的表達。在酵母細胞中，Ras/PKA通路通過抑制TOR而抑制自噬，表明Ras/PKA通路抑制自噬作用與TOR-Tap42通路平行。Atgl作為PKA的磷酸化底物可能參與到Ras/PKA通路的調節當中，使Ras/PKA抑制自噬得以實現。同時酵母細胞中的sch9與哺乳作用與動物細胞中的PKB/Akt相似，也參與感受細胞外葡萄糖水平。

3.4 AMPK途徑 自噬活性對細胞存活十分重要。在哺乳動物細胞中，AMPK感受ATP的水平。通過上游激酶LKBl下調ATP/AMP比例而激活AMPK。活性的AMPK誘導TSCl/2復合體磷酸化并有活性，TSCl/2復合體可通過Rheb抑制mTOR活性。除此之外，LKBl-AMPK使P27磷酸化并有活性，后者可在生長因子缺乏或營養缺乏時阻滯細胞凋亡而誘導自噬。與AMPK相同，酵母細胞中的Snfl也可正向誘導自噬。

4 自噬和缺血性腦卒中

自噬(autophagy)是細胞適應惡劣環境的一種生存機制，通過這種方式細胞可以獲取制造ATP、保證基本代謝過程的營養物質，從而限制其損傷和死亡。從這一觀點出發，認為自噬具有神經保護作用〔20〕。Puyal和 Clarke〔21〕在大鼠腦缺血模型研究中觀察到，缺血灶周圍腦組織神經元中的溶酶體和自噬活動均顯著增強，認為自噬活動對缺血周圍腦組織具有保護作用。有研究表明腦缺血缺氧后，自噬基因ATG7缺失的新生鼠較正常新生鼠能夠有效的減輕腦損傷，不但能夠減少自噬性死亡，而且減少了凋亡;ATG7缺失的成年鼠腦缺血缺氧后，自噬性死亡是海馬錐體細胞死亡的重要方式〔22〕。Carloni等〔23〕在新生小鼠缺血缺氧性腦損傷模型研究中發現，腦缺血后海馬和大腦皮質神經元中的自噬相關基因Beclin-1表達上調，并在24 h達高峰;同樣，IPC后Beclin-l表達也顯著上調。在缺血前20 min經側腦室注入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3.methyladenine，3-MA)可顯著下調Beclin-l表達，同時海馬和皮質神經元死亡顯著增多;相反，經側腦室注入自噬激活劑雷帕霉素(rapomycin)可顯著上調Beclin-1表達，同時海馬和皮質神經元死亡顯著減少。最近，Carloni等〔24〕進一步研究發現，自噬激活劑雷帕霉素能抑制核糖體s6蛋白激酶(ribosomes 6 protein kinase，pTOS6K)磷酸化以及顯著上調Beclin-l和LC3表達，而自噬抑制劑渥曼青霉素(wort，mnnin)可顯著減少Akt和cAMP的應答元件結合蛋白(eAIVIPresponse element-binding protein，CREB)磷酸化，但不會影響p70S6K磷酸化以及Beclin-I和I.L-3表達。Tizon等〔25〕證實，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C，CysC)可以通過抑制哺乳動物mTOR通路誘導細胞自噬，從而保護小鼠皮質神經元。因此認為通過調節CysC表達有望為缺血性卒中的一個治療靶點。

但現有的研究結果卻并不完全一致。因過度激活的自噬會引起Ⅱ型細胞發生程序性死亡，故有學者又認為自噬的激活也是導致神經元死亡的重要原因〔26，27〕。成年大鼠大腦中動脈閉塞模型研究表明，缺血半暗帶區域的自噬顯著激活，應用自噬抑制劑3-MA或巴弗洛霉素A1(bafliomycin A1)阻斷自噬，可使梗死體積顯著縮小，腦水腫和大鼠行為學損害均得到顯著改善〔28，29〕。Koike 等〔30〕采 用 自 噬 基 因 缺 陷 大 鼠、胱 冬 酶(caspase)-3基因缺陷大鼠以及胱冬酶活化DNA酶抑制大鼠模型來分析腦缺血缺氧性損傷后的神經元死亡情況，結果證實，自噬基因Atg7表達陰性的大鼠海馬錐體細胞自噬受到明顯抑制，同時海馬區神經元死亡較對照組明顯減少。由此推測，自噬的產生可能會加重神經元損害，促進其死亡，從而對自噬在腦缺血后的保護作用提出了質疑。因此，自噬在腦缺血缺氧性損害中的確切作用仍然存在爭議，自噬是加重還是減輕缺血后神經元損害尚需進一步的研究證實。

5 展望

隨著國內外學者對細胞自噬在心腦血管缺血缺氧、缺血再灌注及細胞凋亡等方面的研究，自噬同腦卒中的密切關系正被人們發現并重視。對腦卒后缺血半暗帶的保護一直是國內外學者研究的熱點，而自噬在腦缺血半暗帶病理生理變化中扮演著重要的角色。相信隨著分子生物學研究的進一步深化，我們能夠找到自噬通路中某些關鍵的靶點。通過這些關鍵點我們可能成功逆轉某些卒中病人的神經功能損害，為人類的健康作出里程碑式的貢獻。

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