丹參多酚酸鹽抑制急性冠脈綜合癥血小板膜糖蛋白表達的臨床研究

劉磊，溫志超，羅心平，李劍*，施海明，范維琥

(1.復旦大學附屬華山醫院心內科，上海200040;2.復旦大學附屬金山醫院心內科，上海200540)

丹參水溶性提取物多酚酸鹽，其主要成分丹參乙酸鎂的化學結構已被闡明，且治療冠心病心絞痛的臨床療效已經肯定，但具體作用機制卻報道較少。本科既往的臨床研究已提示該藥的抗心絞痛作用與抑制二磷酸腺苷(ADP)刺激引起血小板的聚集有關［1］;據此推測:丹參多酚酸鹽對血小板活化能力的良性影響與血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復合物和顆粒膜蛋白P選擇素相聯系，而這兩項指標是反映血小板活化的常用臨床指標［2］，急性冠脈綜合癥(ACS)患者上述糖蛋白表達水平高于正常人［3］。本課題旨在從細胞水平進一步研究ACS患者血小板表面與活性有關的糖蛋白表達，通過全血法流式細胞術檢測血小板基礎狀態以及ADP誘導活化后的PAC-1和CD62P表達比例，探明丹參多酚酸鹽對血小板活化影響的具體機制。

1 資料和方法

1.1 研究對象、入選與排除標準

1.1.1 研究對象2010年11月1日—2011年4月31日期間在我院確診為急性冠脈綜合癥的患者。健康志愿者為復旦大學上海醫學院招募的醫學生。

1.1.2 急性冠脈綜合癥患者入選標準年齡＞18周歲，＜75周歲;臨床首次確診為急性冠脈綜合癥，符合2007年美國心臟病學會(ACC)和美國心臟協會(AHA)關于急性心肌梗塞(AMI)及不穩定心絞痛(UAP)的診斷標準［4］，愿意參加本研究。

1.1.3 排除標準①已經確診ACS并經過治療，再次發病者;②計劃給予血小板GPⅡb/Ⅲa拮抗劑或者靜脈溶拴治療者;③因其他原因長期使用抗血小板或者抗凝治療者;接受中藥活血化瘀治療者;④慢性心功能不全，NYHA分級II級以上者;合并急性左心功能不全;心臟瓣膜病;⑤半年內任何外科手術史;半年內確診的出血性疾病史或者出血傾向;⑥嚴重肝腎功能不全;疑診或確診為惡性腫瘤;任何感染的急性期;⑦對使用丹參及中藥成分過敏者。

1.2 臨床資料的記錄采集病史、一般資料和體格檢查，根據入院先后順序分組。所有治療開始前進行采血，收集首次血常規、肝腎功能、超敏C反應蛋白(Hs-CRP)、凝血功能;十二導聯心電圖和多普勒超聲左心室射血分數，并根據結果再次進行篩選。隨訪:治療第8天，6個月時隨訪心血管主要終點事件，包括死亡、復發性心梗、嚴重心衰，以電話、門診方式進行隨訪。

1.3 分組和給藥方法本研究分為標準治療加上注射用丹參多酚酸鹽組(A組)(藥品由上海綠谷制藥有限公司提供，規格:200 mg:160 mg丹參乙酸鎂，批號091108)和標準治療組(B組)。A組給予指南建議的標準治療+注射用丹參多酚酸鹽200 mg/d，B組給予指南建議的標準治療，共7 d，第8天停用丹參多酚酸鹽，繼續給予標準治療。標準治療指根據現有ACC/AHA 2007年指南［4］，針對急性冠脈綜合癥的治療:包括腸溶阿司匹林和氯吡格雷(波立維)(首次分別予以300 mg頓服，次日以0.1 g/d和75 mg/d維持)、他汀類(阿托伐他汀鈣片20 mg/d)、低分子肝素(依諾肝素鈉4 000IU皮下注射，每12 h一次，共3 d)，并根據病情選擇用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)、β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑、硝酸酯類藥物，不再加用其他類中成藥物。詳細記錄患者用藥過程中的癥狀、體征。選取的急性冠脈綜合癥患者均在入院后48 h內接受冠狀動脈造影檢查。

1.4 患者標本采集及處理兩組患者均采血兩次，首次在入院后即刻(抗血小板治療前)，以及治療后第8天清晨采血。使用1∶6枸櫞酸鈉抗凝管，于肘正中靜脈用粗針頭抽取兩管血共4 mL，第二管進行聚集率和全血法流式細胞儀檢測(第一管可作它用)，輕輕旋轉混勻，避免強烈振蕩。用于流式細胞儀檢測的血樣在床邊進行預處理。

1.5 血小板功能測定

1.5.1 血小板聚集率檢測血樣采集后立即離心提取血小板，重懸在Hepes-Tyrode緩沖液(137 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，3.7 mmol/L KCl，5.6 mmol/L葡萄糖，1 g/L BSA，3.3 mmol/L NaH2PO4和20 mmol/L Hepes)中。10 min內送檢，用比濁法置入血小板雙通道聚集儀中分析。在37℃恒溫下加入誘導劑，血小板聚集率以百分比計。誘導劑分別為二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、膠原(COL)(購自Sigma公司)，其終濃度分別為10 μmol/L、0.5 mmol/L和2 μg/mL。

1.5.2 全血法流式細胞儀檢測［5］三色流式分析法血小板活化檢測試劑:CD42b-APC抗體;PAC-1-FITC及其對照同型大鼠免疫球蛋白抗體;CD62p-PE及其對照同型大鼠免疫球蛋白抗體;均購自Santacruz公司。實驗室內提前避光分裝熒光抗體，病房采血后床邊進行全血稀釋和抗體孵育。人工活化血小板使用終濃度10 μmol/L的ADP。具體步驟如下:取出30 μL全血，加入Hepes-Tyrode緩沖液稀釋至300 μL;每一標本取流式管A、B，均加入稀釋全血10 μL;A管:PAC-1(FITC標記)、CD62p(rPE標記)、CD42b(APC標記);B管:PAC-1同型、CD62p同型、CD42b;在FLl的補償管中，加入FITC-IgM、PE-CD62P及CD42b單抗。在FL2的補償管中，加入F1TC-PAC-l、PE-IgGl及CD42b單抗。室溫避光孵育15min;最后加入1%多聚甲醛固定，置于4℃避光保存，30 min內于華山醫院中心實驗室流式細胞儀(FACS Calibur，Becton Dickinson)上檢測。血小板PAC-1及CD62p含量以其陽性血小板百分率表示。

1.5.3 血小板胞漿內鈣釋放測定［6］Fluo3/AM(鈣離子熒光探針)以及F127均購自美國Biotium公司，1 mg Fluo3/AM溶解于含有20%F127的二甲亞砜(DMSO)溶液，配制為1 mmol/L貯備液。健康志愿者抗凝全血離心分離得血小板。用無鈣清洗液洗滌1次并配成2×108mL的血小板懸液，分別加入終濃度為2 μmol/L的Fluo3/AM，避光置37℃孵育20 min，然后用無鈣清洗液洗滌2次，用含0.5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)的Tyrode緩沖液配成血小板懸浮液。負載血小板懸液加入丹參多酚酸鹽孵育5 min后加入ADP(終濃度10 μmol/L)，在日立F4500熒光分光光度儀上進行檢測，使用生理鹽水作為空白對照。固定發射波長于527 nm，激發波長分別固定在506 nm，記錄Fluo3在激發波長506 nm處的熒光強度比值。

1.6 數據統計所得數據使用SPSS17.0建立數據庫，正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用配對的t檢驗或方差分析;非正態分布的計量資料以四分位數表示，組間比較采用秩和檢驗;計數資料以百分比表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher檢驗。P＜0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基線資料的比較本研究截至2011年4月31日，共納入病例70人，占同期華山醫院心內科確診急性冠脈綜合癥患者的27%，研究過程中因死亡剔除4人，失訪3人。最后完成兩次采血并入選的患者為63人;其中A組32人，B組31人，平均年齡(66±10)歲;男性43人(占68.2%)，女性20人(占31.7%)(見表1)。主要生化指標及參數:治療后兩組部分凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶原時間(APTT)以及國際標準化比值(INR)無顯著差異;治療后A組hs-CRP低于B組(P＜0.05);治療后8 d，A組左室射血分數高于B組(P＜0.05)(見表2)。

表1 各組患者臨床基線特征的比較Tab.1 Com parison of baseline clinical characteristics w ithin each group

表2 兩組治療前后凝血功能、Hs-CRP、EF值比較Tab.2 Comparison of the variation of coagulation，Hs-CRP and EF value between two groups before and after treatment

2.2 血小板功能檢測結果

2.2.1 血小板聚集率治療前A、B兩組患者血小板最大聚集率無統計學差異。治療后，在誘導劑ADP的作用下，A組血小板最大聚集率低于B組(49.20±6.12)%比(53.39±6.32)%，P＜0.05;在誘導劑AA的作用下，A、B兩組比較最大聚集率無統計學差異(44.96±20.40)%比(45.75±12.89)%，P＞0.01;在誘導劑COL的作用下，A組最大聚集率低于B組(46.52±6.36)%比(49.47±4.45)%，P＜0.05(見圖1)。

圖1 治療后兩組患者血小板最大聚集率組間比較Fig.1 Comparison of the variation of p latelet aggregation rate between two groups after treatment

2.2.2 血小板靜息狀態糖蛋白表達治療前，兩組基礎狀態血小板糖蛋白比例分別為PAC-1:A組(10.16±6.46)%;B組(9.69±3.93)%。CD62P:A組(7.03±3.47)%;B組(7.76±2.80)%，組間比較沒有統計學差異。治療后兩組糖蛋白比例均較治療前下降，分別為PAC-1:A組(6.24±2.83)%;B組(5.54±1.38)%。CD62P:A組(4.52±2.34)%;B組(4.74±1.66)%，組間比較兩組沒有顯著差異。

2.2.3 血小板活化狀態糖蛋白表達使用ADP誘導血小板活化，治療前兩組糖蛋白的比例分別為PAC-1:A組(71.82±12.66)%;B組(69.87±8.03)%。CD62P:A組(58.97±13.46)%;B組(60.02±10.53)%，組間比較沒有統計學差異。治療后，A組血小板PAC-1表達比例低于B組(47.05±10.04)%比(52.18±6.18)%，P＜0.05，A組血小板CD62P表達低于B組(39.48±8.33)%比(45.04±6.68)%，P＜0.01，見圖2。

2.2.4 血小板胞漿內鈣釋放血小板與質量濃度為200 mg/L的丹參多酚酸鹽孵育后，與未干預的血小板進行比較，高濃度的丹參多酚酸鹽不能完全抑制ADP作用于P2Y1受體引起的胞漿內鈣釋放(見圖3)。

圖2 兩組患者治療前后ADP誘導血小板活化PAC-1、CD62p表達Fig.2 Comparison of the variation of platelet glycoprotein between two groups before and after treatment

圖3 血小板胞漿內鈣釋放Fig.3 Effect on ADP-induced［Ca2+］i mobilization in platelets

2.3 終點事件在整個治療以及隨訪過程中，兩組患者均未再發心肌梗死;A組有2例患者出現嚴重心衰，B組共有6例患者出現嚴重心衰;A組死亡患者1例，B組3例。

3 討論

丹參治療冠心病的歷史悠久且療效確切，近十年來，中科院上海藥物研究所的科研人員發現丹參水溶性有效成分中以丹參乙酸鎂為主的丹參多酚酸鹽(含丹參乙酸鎂＞60%～80%)，在丹參保護心血管系統中發揮重要作用［7］。本研究中觀察到，所有患者對丹參多酚酸鹽耐受良好，臨床癥狀明顯改善，血常規、肝腎功能指標穩定。在試驗過程中A組與B組的患者未報告出血不良事件，未發生自發血尿、嘔血等出血事件。通過治療后比較兩組患者凝血功能指標，兩組差異不顯著，說明在標準治療的基礎上加用丹參多酚酸鹽沒有增加患者的出血風險。

既往的資料大部分來源于穩定型心絞痛患者的臨床研究，本研究中我們選取了血小板異常活化的急性冠脈綜合癥患者作為研究對象，并采用不同的激動劑刺激來觀察加用丹參多酚酸鹽治療后，患者血小板表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復合物和P選擇素表達的變化。血小板糖蛋白受體是血小板黏附到血管壁的成分和血小板間相互作用的關鍵物質，其中纖維蛋白原受體GPⅡb/Ⅲa是血小板膜上最豐富的受體，各種刺激血小板聚集的物質與各自受體結合后，都必須經血小板GPIIb/IIIa受體與纖維蛋白原配體結合才能引起血小板聚集，為血小板聚集的最終途經［2］。P選擇素是選擇素家族的一員，它只能在脫顆粒的血小板表面表達，介導血小板與內皮細胞、中性粒細胞間的黏附，啟動血栓形成的全過程，可作為血小板活化的分子標志物之一［2］。在治療后，我們觀察到兩組患者基礎狀態PAC-1以及CD62P的表達比例均較治療前下降;而用ADP刺激血小板活化后，組間比較PAC-1以及CD62P的表達比例，發現治療組低于對照組(PAC-1:P＜0.05和CD62P:P＜0.01)，說明丹參多酚酸鹽抑制了急性冠脈綜合癥患者血小板聚集最終途徑重要糖蛋白表達。我們還發現，在誘導劑ADP和膠原的作用下，治療組患者治療后血小板最大聚集率低于對照組，而膠原與血小板內源性的ADP釋放有關［8］，提示丹參多酚酸鹽可能具有潛在的影響血小板ADP受體后信號通路的能力。ADP是體內重要的誘導血小板聚集的物質，以P2Y12受體為靶點的抗血小板藥的研究一直是近年來的研究熱點［9］。血小板的兩種主要ADP受體有著各自的功能與作用機制，P2Y12受體激活時抑制腺苷酸環化酶活性并降低環磷酸腺苷濃度;P2Y1受體的激活與Gq蛋白偶聯，通過磷脂酰肌醇的水解引起胞內貯存Ca2+的釋放和血小板聚集，血小板的正常功能必須有兩種受體的共同參與［10］。本研究中使用單波長鈣熒光指示劑Fluo3，通過EGTA螯合血小板懸液中的外鈣，測定在ADP刺激后P2Y1信號通路下胞漿內鈣釋放情況，發現高于體內有效血藥濃度［11］的丹參多酚酸鹽也不能完全抑制內鈣釋放，提示該藥物的主要抗血小板途徑可能是通過影響P2Y12信號通路來實現的［12］。

早期動物研究提示水溶性丹參組份能減低LDLR(-/-)小鼠CRP，減輕炎癥環境［13］，與我們本次研究中觀察到丹參多酚酸鹽對患者Hs-CRP水平的影響是一致的。由于血小板參與了炎癥反應，而抗血小板治療可降低血清CRP水平［14］，所以丹參多酚酸鹽抗炎作用可能也是建立在其抗血小板作用基礎之上。研究中我們還觀察到兩組患者治療后EF值均較治療前升高，但治療組患者心功能改善優于對照組(P＜0.05)，提示治療組患者心功能有提前恢復的趨勢，這可能與丹參多酚酸鹽減輕心肌耗氧量以及擴張血管作用有關［15］。動物實驗也證明，抗血小板治療可以減輕急性心肌梗死引起的缺血以及再灌注損傷［16］，縮小梗死范圍，改善心功能。

本研究提示:以丹參乙酸鎂為主要成分的丹參多酚酸鹽，對急性冠脈綜合癥的療效與改善血小板功能有關，其對血小板的作用環節主要在P2Y12受體后信號通路上。丹參多酚酸鹽對血小板P2Y12受體信號通路的具體作用可能是單靶點，也可能存在多靶點的作用，將在后續研究中進一步證實。

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