維藥毛菊苣降糖有效部位的純化工藝

張堯，信學雷，阿吉艾克拜爾·艾薩*

(1.中國科學院新疆理化技術研究所新疆特有藥用資源利用國家重點實驗室培育基地，新疆烏魯木齊830011;2.中國科學院研究生院，北京100049)

毛菊苣Cichorium glandulosumBoiss.et Huet屬于菊科菊苣屬，主要分布于我國新疆，為維吾爾族民間保肝利膽、利尿用藥，該植物已被《中華人民共和國藥典》、《中國民族藥志》及《新疆中草藥》收錄［1，2］。毛菊苣氣微、味咸、微苦，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫功效;用于濕熱黃疸、胃痛食少、水腫尿少［3］。目前，已知毛菊苣主要含三萜、倍半萜內酯、香豆素、黃酮、糖類、有機酸等多種成分［4-6］。現代藥理表明，菊苣具有降血糖作用［7］，但有關降糖有效部位的工藝研究尚未見報道。本實驗旨在優化毛菊苣降糖有效部位的純化工藝，通過考查9種不同類型的大孔樹脂的靜態吸附-解吸附能力，以產率、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)抑制率、ABTS抗氧化能力、醛糖還原酶(AR)抑制率為指標，篩選最優樹脂，并對其純化條件進行優化，確定最佳純化工藝，為工業化生產提供了理論依據。

1 儀器與材料

旋轉蒸發儀:Buchi R—210型(瑞士產);真空干燥箱:DZF—6050B型(上海齊欣科學儀器有限公司);全溫震蕩培養箱:HZQ—F160型(上海市實驗儀器總廠);M—5酶標儀(美國分子儀器公司)。

HPD100，HPD300，HPD450，HPD600，HPD750，ADS-17型大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司);X-5，D4020，D140，型大孔樹脂(南開大學化工廠);毛菊苣購自新疆維吾爾自治區吉姆薩爾縣，由中國科學院新疆生態與地理研究所張立運研究員鑒定為Cichorium glandulosumBoiss.et Huet;ABST由美國Amresco公司提供，對硝基苯磷酸二鈉鹽(PNPP)由美國Sigma公司提供，還原型輔酶Ⅱ鈉鹽試劑(NADPH)購自Roche公司，DL-甘油醛和二甲基亞砜(DMSO)均為國產分析純試劑，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 毛菊苣提取液的制備取毛菊苣莖1.8 kg，根據文獻［8］所述的方法提取藥材，過濾，合并濾液，用旋轉蒸發儀濃縮藥液相對密度至1.04。

2.2 樹脂的篩選根據文獻［9-10］的方法，將9種大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h，用95%乙醇洗滌樹脂，直至流出液加3倍體積水無白色沉淀。用水洗柱，直至無醇味;抽濾。稱取9種已處理好的大孔樹脂1 g放入錐形瓶，將毛菊苣提取液稀釋成上樣液(樣品質量濃度P0為28.735 g/mL)，加入10 mL毛菊苣上樣液。置搖床，振搖(180 r/min，25℃)2 h，放置12 h。過濾，濾出液烘干至恒定質量，計算濃度Pe。過濾提取液處理后的大孔樹脂水洗抽干，加95%乙醇10 mL，置搖床(180 r/min，25℃)振搖2 h，放置2 h進行靜態解吸附。解吸液過濾烘干至恒定質量，計算濃度Pd。

V0為上樣體積，M為樹脂質量。分別按下式計算吸附量、吸附率、解吸率:

吸附量(mg/g濕樹脂)=(P0－Pe)×V0/M

吸附率(%)=(P0－Pe)×100/P0

解吸率(%)=Pd×100/(P0－Pe)

解吸附的樣品進行活性測定。按照文獻［11］的方法測定PTP1B抑制率，即在96孔板中加入PTP1B蛋白溶液1 μL(0.115 mg/mL)，測試樣品或陽性對照樣品1 μL或DMSO 1 μL，PBS緩沖液96 μL混勻，10 min后加入PNPP 2 μL，使其終濃度為2 mmol/L。30℃孵育30 min后，用3 mol/L NaOH終止反應，在405 nm測定吸收值，以不含酶溶液的系統為空白。

抑制率=(OD405空白－OD405樣品)/OD405空白×100%。

按照文獻［12-13］的方法測定ABTS試劑盒抗氧化活性，即將5 mL的7 mmoL/L的過硫酸鉀混合，在室溫，避光的條件下靜置過夜，形成ABTS自由基貯備液，使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30℃，734 nm波長下的吸光度值為0.7+0.02。測定時取不同濃度的樣品液16 μL，加入184 μL的ABTS溶液，準確振30 s，在20℃下測定反應液在734 nm處6 min內的吸光值。實驗以VC為陽性對照，設試劑空白，樣品空白和樣品實驗組。

抑制率=［1－(At－B)/A0］×100%

其中，A0為未加樣品的吸光值;At為樣品與ABTS反應后的吸光值;B為樣品空白的吸光值。

將文獻［14］的方法進行改進測定醛糖還原酶(AR)抑制率，即反應體系200 μL，包括0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7)148 μL，2 mmol/L的NADPH 20 μL，10 mmol/L的DL-甘油醛20 μL，酶液10 μL，以及不同樹脂過下來的毛菊苣純化液。充分混勻后室溫放置10 min，用酶標儀檢測340 nm處吸光值。樣品對AR的抑制率計算如下:

抑制率(%)=［1－(A2－A0)/(A1－A0)］×100%

式中，A0表示未加酶、底物和樣品，即每分鐘NADPH自然氧化吸光值的下降;A1表示未加樣品每分鐘NADPH吸光值的下降;A2為加樣品后每分鐘NADPH吸光值的下降。

計算各指標IC50，并結合吸附率、解吸率進行綜合評分，結果見表1。

表1 9種大孔樹脂靜態吸附-解吸附情況Tab.1 Adsorption and desorption performance of nine kinds of macroporous resin

由表1可以看出，HPD450、HPD750、X-5、ADS-17、D4020型號樹脂對毛菊苣提取液有較強的吸附效果，HPD600和D4020解吸效果比較好，HPD100、HPD300、HPD600、ADS-17等吸附產物各項活性較好。由于純化的目的是得到活性較高的有效部位，因此加入了活性因素綜合評分后(吸附率、解吸率、PTP1B抑制率、ABTS抗氧化性、醛糖還原酶抑制率各占20%)，HPD100得分最高，所以選擇HPD100大孔吸附樹脂來純化毛菊苣降糖有效部位。

2.3 純化條件的研究根據文獻［15-16］的方法分別對上樣濃度、吸附速率、上樣量、洗脫劑濃度和洗脫劑用量進行考察。

2.3.1 藥液質量濃度的考察取毛菊苣提取液(質量濃度為100 mg/mL)及由其配制成的質量濃度為75、50、25 mg/mL的溶液各15 mL，分別加入HPD100大孔吸附樹脂柱上，以2 BV/h的速度進行吸附后，收集流出液，計算吸附量。結果如圖1。

圖1 上樣液濃度的影響Fig.1 Effect of sam p le concentration on adsorption

由圖1可以看出，隨著藥液濃度的稀釋，吸附量先增后減，當藥液質量濃度為75 mg/mL時，吸附量達到最大，當大于此質量濃度時，吸附量呈下降趨勢。因此選擇上樣液質量濃度為75 mg/mL(密度相當于1.04 g/mL)。

2.3.2 吸附速率的考察取毛菊苣提取液(75 mg/mL)30 mL，吸附在15 mL樹脂柱上，分別以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h的流速進行吸附后，收集流出液，計算吸附量。結果如圖2。

由圖2可以看出，當吸附速率增加時，吸附量先增后減。當吸附速率達到3 BV/h時，吸附量達到最大。因此選擇吸附速率為3 BV/h。

2.3.3 上樣量的考察取毛菊苣提取液(75 mg/mL)200 mL，上15 mL樹脂柱，以3 BV/h的速度進行吸附后，收集流出液，測定吸附量。樣品穿透曲線見圖3。

圖2 吸附速率的影響Fig.2 Effect of flow rate on adsorption

圖3 樣品穿透曲線Fig.3 Effect of sample volume on adsorption

從樣品穿透曲線來看，上樣量從6 BV開始，穿透速度趨于平緩，達到一個動態平衡，且流出液與上樣液濃度幾乎相等。因此上樣量為6 BV時，樹脂柱已接近吸附飽和。

2.3.4 洗脫劑濃度的考察取毛菊苣提取液(75 mg/mL)400 mL，加入15 mL樹脂柱上，以3 BV/h的流速進行吸附，再以5 BV/h流速用水洗4 BV后，分別用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液洗脫50 mL，收集洗脫液測定PTP-1B半數抑制濃度IC50。結果如表2。

表2 不同濃度乙醇洗脫組分PTP-1B抑制IC50Tab.2 Effect of eluent concentration on elution

由表2可知，隨乙醇質量分數升高，洗脫組分對PTP-1B的抑制活性依次降低。其中20%，40%和60%乙醇洗脫部分活性較好，但純化組分量依次增加。綜合純化組分產量與活性，選用60%乙醇作為洗脫濃度。

2.3.5 洗脫劑用量的考察將吸附飽和的樹脂先用水洗4 BV去除殘余樣品，再用60%的乙醇以3 BV/h的流速分別洗脫1、2、3、4、5、6、7、8 BV，收集流出液測定其濃度。結果如圖4。

圖4 洗脫劑用量的影響Fig.4 Effect of eluent volume on elution

由圖4可以看出，洗脫劑用量大于5 BV時，流出液里的樣品濃度變化很小，趨于不變，說明洗脫劑在5 BV時大孔樹脂上吸附的物質基本被洗脫干凈。對工廠生產來說，為了高效又節約成本，我們選擇洗脫劑的用量為5 BV。

3 討論

大孔吸附樹脂對樣品的吸附能力取決于樹脂的理化性質，如比表面積，孔徑，孔隙率以及由樹脂的材料決定樹脂的極性［17］。樣品與樹脂通過氫鍵，范德華引力等作用力結合到樹脂的表面或內部，利用這些作用力強弱的不同而實現分離;或利用篩選性原理，不同分子大小的物質在樹脂孔隙中的保留能力不同而實現分離［18］。本實驗中，通過靜態吸附法篩選幾種不同類型的樹脂的吸附-解吸附能力，結合活性篩選結果確定非極性HPD100樹脂為最佳吸附劑，在動態吸附法研究HPD100的純化條件中，20%，40%，60%乙醇洗脫組分的活性較好。綜上，毛菊苣中降糖有效組分可能主要為中等極性成分。本實驗利用糖尿病相關因子的多靶點活性篩選作為工藝篩選指標，其目的性強，方法可靠，對食品藥品純化工藝研究有一定的參考意義。

4 結論

通過對大孔樹脂吸附和解吸附性能的考察，及各種影響吸附的條件的系統考察，確定了大孔樹脂純化毛菊苣提取液有效部位的最佳工藝為:HPD100型大孔樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)，上樣質量濃度為75 mg/mL，吸附速率為3 BV/h，上樣量達到6 BV時產量最高。洗脫時先用水以5 BV/h的流速洗4 BV除雜，再用60%乙醇以3 BV/h洗脫5 BV，活性與產量綜合評分最優。此方法簡便易行，周期短、成本低，可以用于工業生產毛菊苣降糖有效部位。

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