HPLC 法同時測定補肺益腎顆粒中淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷

李娟，趙迪，周悌強，馮素香，李建生

(河南中醫學院，河南鄭州450008)

補肺益腎顆粒處方是在原補肺益腎處方基礎上精簡而成［1-2］，由淫羊藿、陳皮、赤芍、黃芪、五味子、山茱萸等十二味中藥組成，現為河南中醫學院第一附屬醫院制劑。該方具有補肺益腎、化痰、活血的功效，是中醫治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)穩定期肺腎氣虛證的有效藥物，可減輕炎癥反應和黏液分泌，減少對氣道壁的損傷，減輕氣道阻塞，從而降低對肺組織的損傷，延緩肺功能的下降［3-6］。其中淫羊藿為方中君藥，陳皮、赤芍為方中臣藥，原質控標準僅對該顆粒劑中淫羊藿苷進行測定，不能全面反映產品質量信息。為有效控制產品質量，本實驗采用HPLC法同時對該顆粒劑中有效成分淫羊藿苷、橙皮苷和芍藥苷進行定量分析，為建立簡便易行的質量控制方法提供依據。

1 儀器、試藥

1.1 儀器Waters高效液相色譜儀(2695高效液相泵，2996二極管陣列檢測器，Empower 2工作站;美國waters公司);SHZ—D(Ⅲ)型循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司);KH—2200DB型數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司);Sarterius BS 224S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);EYELA N—1100旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司);HH—6型數控恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司)。

1.2 試藥芍藥苷(批號0736-200414)、淫羊藿苷(批號0737-9709)、橙皮苷(批號0773-9809)均購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈(HPLC級，Grace Company INC)，甲醇(分析純，天津四友精細化學品有限公司)，磷酸(分析純，天津鷗博凱化工有限公司)，娃哈哈純凈水;補肺益腎顆粒(河南中醫學院第一附屬醫院藥劑科提供)。

赤芍、淫羊藿、陳皮等藥材均購自河南鄭州張仲景大藥房，經河南中醫學院陳隨清教授鑒定分別為毛茛科植物川赤芍Paeonia veitchiiLynch的干燥根、小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornumMaxim.的干燥地上部分、蕓香科植物橘Citrus reticulateBlanco的干燥成熟果皮等。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)(博納艾杰爾科技有限公司)，柱溫:25℃;流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脫(A%為19→19→28→28，相應時間周期為0→6→7→20min);體積流量:1.0 mL/min;檢測波長:270 nm。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含淫羊藿苷0.112mg、橙皮苷0.359 mg、芍藥苷0.258 mg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取本品約2 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備按處方量并以相同的工藝分別制備不含淫羊藿、陳皮、赤芍的陰性對照樣品，照上述供試品溶液制備方法處理，得陰性對照溶液。

2.5 專屬性實驗精密吸取對照品、供試品及陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀進行測定。結果陰性對照色譜中，在與對照品及供試品色譜圖對應保留時間處無相應色譜峰，表明其它組份對測定淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷3個成分無干擾，見圖1。

圖1 對照品(A)、供試品(B)、缺赤芍陰性樣品(C)、缺陳皮陰性樣品(D)和缺淫羊藿陰性樣品(E)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of m ixed reference substancea(A)，sample(B)，negative sample without Paeoniae Radix rubra(C)，negative sample without Citri reticulatae Pericarpium(D)，negative sample without Epimedii Folium(E)

2.6 線性關系考察分別精密量取2.2項下的對照品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為對照品溶液。精密吸取2、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，峰面積和進樣量分別取對數得Y和X，并以Y對X進行回歸分析，得到淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的回歸方程，見表1。

表1 線性關系考察結果Tab.1 Results of linear correlation

結果表明:淫羊藿苷在0.022 4～0.280 μg，橙皮苷在0.071 8～0.898 μg，芍藥苷在0.051 6～0.645 μg范圍內有良好的線性關系。

2.7 精密度實驗照上述HPLC色譜條件，對同一對照品溶液連續進樣6次，以峰面積為指標考察儀器的精密度，結果表明，淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷對照品峰面積的RSD分別為1.2%、1.4%、1.1%。

2.8 穩定性實驗取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、12 h分別進樣20 μL進行HPLC測定，淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、0.8%，表明樣品供試液在12 h內穩定性良好。

2.9 重復性實驗取同一批樣品6份，制備供試品溶液，按上述HPLC色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算，結果淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質量分數分別為0.087 6 mg/g、0.367 mg/g、0.243 mg/g，RSD分別為2.17%、2.43%、2.29%，表明重復性良好。

2.10 耐用性實驗

2.10.1 不同色譜柱精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，選取不同的色譜柱(艾杰爾，V9510525CL0028;依利特，E1517560;Waters，WAT045905)進行分離，其它色譜條件不變，進行測定，結果淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質量分數分別為0.088 0 mg/g、0.363 mg/g、0.247 mg/g，RSD分別為2.56%、2.31%、2.19%。

2.10.2 不同柱溫精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，柱溫分別設定為20℃、25℃、30℃，其它色譜條件不變，進行測定，結果淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質量分數分別為0.087 2 mg/g、0.371 mg/g、0.239 mg/g，RSD分別為2.15%、2.48%、2.34%。

2.10.3 不同波長精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，波長分別設定為265 nm、270 nm、275 nm，其它色譜條件不變，進行測定，結果淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質量分數分別為0.087 4 mg/g、0.366 mg/g、0.242 mg/g，RSD分別為1.98%、2.23%、2.68%。

以上結果表明不同色譜柱、不同柱溫、波長的微小變化對樣品色譜峰的分離度和含量測定結果均未有明顯影響。

2.11 加樣回收率實驗取已知含有量(淫羊藿苷0.087 8 mg/g，橙皮苷0.369 mg/g，芍藥苷0.245 mg/g)的補肺益腎顆粒約1 g，共9份，精密稱定，分為3組，每組分別加入質量濃度為0.112 mg/mL的淫羊藿苷、0.359 mg/mL的橙皮苷、0.258 mg/mL的芍藥苷對照品0.8、1.0、1.2 mL，照上述供試品溶液的制備方法及色譜條件進行測定，結果顯示淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的加樣回收率的RSD分別為2.65%、2.12%、2.36%，見表2～4。

表2 淫羊藿苷加樣回收率實驗結果Tab.2 Results of recovery tests of icariin

表3 橙皮苷加樣回收率實驗結果Tab.3 Results of recovery tests of hesperidin

表4 芍藥苷加樣回收率實驗結果Tab.4 Results of recovery tests of paeoniflorin

2.12 樣品的測定取3批補肺益腎顆粒(20110218、20110425、20110603)，照2.3項下供試品溶液制備方法制備，2.1項下HPLC色譜條件測定，記錄色譜峰面積并計算，測定結果見表5。

表5 3批次樣品測定結果(n=3)Tab.5 Determ ination results of three batches of sam ples(n=3)

3 討論

3.1 提取方法的選擇補肺益腎顆粒為中藥復方制劑，所含成分復雜多樣。顆粒劑含有量測定時供試品溶液制備方法主要有超聲、回流［7-9］。該實驗對這兩種提取方法進行了比較，超聲提取淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質量分數分別為0.056 9 mg/g、0.668 mg/g、0.364 mg/g，RSD分別為2.18%、1.27%、1.58%;回流提取淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質量分數分別為0.057 0 mg/g、0.669 mg/g、0.368 mg/g，RSD分別為1.93%、2.16%、2.41%。結果表明，采用超聲和回流方法提取含有量相近，無顯著性差異。超聲提取操作簡便，因此本實驗選擇超聲處理作為供試品溶液的制備方法。

3.2 檢測波長的選擇該實驗同時測定3個成分，但芍藥苷、淫羊藿苷、橙皮苷的最大吸收波長分別為230 nm、270 nm、320 nm［10-13］，因此本實驗對檢測波長進行了篩選，分別在200～400 nm范圍內不同波長下測定混合對照品，實驗結果表明在270 nm可以同時兼顧這3個成分，且呈良好線性關系，故檢測波長選擇在270 nm。

3.3 洗脫梯度的選擇補肺益腎顆粒中含有多種化學成分，很難找到較為理想的等度洗脫條件。本實驗分別考察了以乙腈-純水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水［14-16］作為流動相時不同濃度和比例的等度以及梯度洗脫的出峰情況，確定了以乙腈-0.1%磷酸水為流動相時分離度較好。通過反復改變乙腈所占比例和變化的時間，最終確定了該實驗的梯度洗脫程序，在此條件下，供試品溶液中淫羊藿苷、橙皮苷和芍藥苷與相鄰成分分離良好，且陰性溶液無干擾。

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