2種保和制劑中齊墩果酸、熊果酸和橙皮苷定量測定及比較分析

楊紅，劉亞蓉

(1.山西藥科職業學院，山西太原030031;2.青海省食品藥品檢驗所，青海西寧810016)

保和丸始載于《丹溪心法》，是自金元時期記載以來沿用至今的傳統中藥名方。處方組成:山楂(焦)、六神曲(炒)、半夏(制)、茯苓、陳皮、連翹、萊菔子(炒)、麥芽(炒)。主要功效消食，導滯，和胃。用于食積停滯，脘腹脹滿，噯腐吞酸，不欲飲食。劑型有大蜜丸、水丸、濃縮丸、片劑、顆粒劑等。其中大蜜丸、水丸為傳統劑型，全部藥材粉碎直接入藥，臨床上也以大蜜丸、水丸為主，二者市場占有量達到全部保和制劑的60%以上。

大蜜丸、水丸收載于《中國藥典》2010年版一部，標準中將橙皮苷作為定量控制指標［1］。本品處方中山楂為君藥，占處方量的37.5%，為原粉直接入藥，本實驗參考有關文獻［2-4］選擇山楂中所含齊墩果酸、熊果酸作為指標，對保和大蜜丸、水丸中山楂進行定量控制，為更全面控制保和大蜜丸、水丸質量提供了依據。同時對所收集到的6家大蜜丸生產企業的35批樣品、4家水丸生產企業的11批樣品按照標準方法進行了橙皮苷的測定及比較，按本文方法進行了齊墩果酸、熊果酸的測定和比較分析，為保和大蜜丸、水丸的質量監管提供了依據。

1 儀器和試藥

1.1 儀器Waters2695高效液相色譜儀，2487二極管陣列檢測器;Milli—QA超純水器(Millipore)。

1.2 試藥乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110742-200415，供定量測定用);齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110709-200304，供定量測定用);橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110721-200512，供定量測定用);樣品(6家大蜜丸生產企業的35批樣品、4家水丸生產企業的11批樣品);陰性藥材購自青海九康藥業有限公司，陰性樣品分別按照大蜜丸、水丸按原標準制備工藝去除焦山楂后制得。

2 方法和結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗SunFireTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為甲醇-乙腈-0.5%醋酸銨(5∶66∶29)，柱溫30℃，體積流量0.9 mL/min;檢測波長210 nm。理論板數按熊果酸峰計算應不低于3 000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸29.4 mg、熊果酸對照品29.2 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL各含齊墩果酸0.294 mg、熊果酸0.292 mg的對照品貯備液，精密量取齊墩果酸對照品溶液2 mL、熊果酸對照品溶液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液(每1 mL含齊墩果酸58.8 μg、熊果酸58.4 μg)。

2.2.2 供試品溶液制備

大蜜丸取大蜜丸約5 g，精密稱定，加硅藻土適量，研細后置索氏提取器中，加入乙醚適量，回流提取4 h，乙醚蒸干，殘渣用甲醇-三氯甲烷(5∶1)混合溶液溶解并定容于10 mL量瓶中，微孔濾膜過濾，制得供試品溶液。

水丸取水丸細粉約2.5 g，精密稱定，加入乙醚適量，索氏提取器中回流4 h，乙醚蒸干，殘渣用甲醇-三氯甲烷(5∶1)混合溶液溶解并定容于10 mL量瓶中，微孔濾膜過濾，制得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備按處方比例稱取藥材(除焦山楂)適量，分別按照大蜜丸、水丸樣品生產工藝制得大蜜丸和水丸的陰性樣品。再依照保和丸供試品溶液的制備方法，分別制成大蜜丸、水丸的陰性對照溶液。在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各5 μL，分別注入液色譜儀。供試品色譜圖中，在與兩種對照品色譜圖相應保留時間上，與對照品有相同的色譜峰，分離度大于1.5，陰性對照在此無干擾，見圖1、2。

圖1 保和丸(大蜜丸)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of Baohe Big Honeyed Pills

圖2 保和丸(水丸)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Bohe W atered Pills

2.3 線性關系考察分別精密量取上述已配制好的齊墩果酸(質量濃度為0.294 mg/mL)、熊果酸(質量濃度為0.292 mg/mL)貯備液0.5、1、2、4、8、10、12 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，分別精密吸取上述對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定。計算回歸方程為:齊墩果酸Y=13 064 278.2X，R=1;熊果酸Y=9 532 773.4X，r=0.999 9。齊墩果酸、熊果酸分別在0.029 4～0.705 6 μg、0.029 2～0.700 8 μg的范圍內有良好的線性關系。

2.4 精密度試驗精密吸取上述已配制好的齊墩果酸、熊果酸對照品溶液(每1 mL含齊墩果酸58.8 μg、熊果酸58.4 μg)，連續進樣5次，每次進樣量為10 μL，結果齊墩果酸、熊果酸RSD分別為2.1%、0.60%。

2.5 重復性試驗取同一批號大蜜丸樣品(河北某藥業有限公司，批號:090204)的樣品5份，水丸樣品(河北某制藥有限公司，批號:090702)按供試品溶液的制備項下的方法制成供試品溶液，每份樣品進2針，在上述色譜條件下，測定樣品齊墩果酸、熊果酸的峰面積，以外標法計算含量。結果大蜜丸齊墩果酸、熊果酸RSD分別為2.0%、1.8%;水丸齊墩果酸、熊果酸RSD分別為1.6%、1.2%。

2.6 穩定性試驗取同一份大蜜丸供試品溶液，水丸供試品溶液按上述色譜條件分別于0、1、2、4、6、8 h測定，結果大蜜丸齊墩果酸、熊果酸RSD分別為2.2%、1.7%;水丸齊墩果酸、熊果酸RSD分別為2.0%、1.3%，說明樣品溶液在配制后8 h內穩定。

2.7 加樣回收率試驗取已測定的大蜜丸(齊墩果酸質量分數為0.13 mg/g、熊果酸質量分數為0.46mg/g)9份，每份稱取約2.5g，精密稱定，分別精密加入齊墩果酸貯備液(0.294 mg/mL)1.30、1.10、0.90 mL各3份、熊果酸貯備液(0.292 mg/mL)5.00、4.00、3.00 mL各3份。取已知測定的水丸樣品(齊墩果酸質量分數為0.22 mg/g、熊果酸質量分數為0.52 mg/g)9份，每份稱取約1.25g，精密稱定，分別精密加入齊墩果酸貯備液(0.294 mg/mL)1.10、0.90、0.70 mL各3份、熊果酸貯備液(0.292 mg/mL)2.60、2.20、1.80 mL各3份。按供試品溶液制備項下的方法制成供試品溶液，并按上述色譜條件測定并計算回收率，結果大蜜丸齊墩果酸、熊果酸平均回收率分別為97.80%、97.60%，RSD分別為1.20%、0.98%;水丸齊墩果酸、熊果酸平均回收率分別為98.85%、99.27%，RSD分別為1.06%、1.10%。保和丸2種劑型加樣回收結果見表1。

3 樣品測定

3.1 齊墩果酸、熊果酸的測定按照上述樣品測定方法對收集到的來自6家生產企業的35批大蜜丸樣品、4家16批水丸樣品中齊墩果酸和熊果酸進行了測定，測定結果見表2，并根據大蜜丸、水丸的服用量對齊墩果酸和熊果酸的攝入量進行了比較，結果見表3。

3.2 橙皮苷的測定按照《中國藥典》2010年版一部方法對收集到的來自6家生產企業的35批大蜜丸樣品、4家16批水丸樣品中橙皮苷進行了測定，測定結果見表2，并根據大蜜丸、水丸的服用量對橙皮苷的攝入量進行了比較，結果見表4。

4 討論

4.1 取已配制好的齊墩果酸、熊果酸對照品溶液，進行紫外掃描(200～400 nm)，二者均在206 nm附近有最大吸收，所以定210 nm為檢測波長。

4.2 根據文獻報道，分別采用甲醇-水-醋酸［2］、甲醇-水-冰乙酸-三乙胺［3］，甲醇-0.5%磷酸溶液［4］，乙腈-水［5］，乙腈-水-磷酸［6-7］，乙腈-1%冰醋酸溶液［8］，甲醇-水-磷酸［9］，乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液［10-11］，乙腈-甲醇-0.6%醋酸銨溶液［12］作為流動相，結果表明，乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨分離效果較好。在此基礎上進行優化，最終確定流動相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨(66∶5∶29)。

4.3 根據齊墩果酸、熊果酸的化學性質及文獻報道［2-7］，分別采用甲醇、無水乙醇、75%乙醇、乙醚作為提取溶媒，實驗結果表明，用無水乙醇、75%乙醇、甲醇提取的供試品溶液顏色較深，色譜峰雜質多，難達到基線分離，用乙醚提取的供試品溶液顏色較淺，雜質少，分離效果較好。

4.4 提取方法，分別采用超聲、水浴回流、索式回流提取樣品各1 h，實驗結果表明索式回流提取的提取率高。

4.5 大蜜丸、水丸中齊墩果酸和熊果酸測定結果表明，大蜜丸生產企業所用山楂原料較為穩定、均一，按次服用齊墩果酸和熊果酸量計，6家生產企業之間及各生產企業不同批次間藥品質量比較穩定。4家水丸生產企業藥品所含齊墩果酸和熊果酸量普遍較大蜜丸高，且個別生產企業不同批次間齊墩果酸和熊果酸量波動較大，每丸齊墩果酸和熊果酸量的最大值是最小值的6倍多，單次服用攝入量差異更大，因此增加并統一保和大蜜丸、水丸中齊墩果酸和熊果酸的定量控制，更能有效控制藥品質量均一性，以保證用藥的有效性。

表2 大蜜丸、水丸中橙皮苷、齊墩果酸、熊果酸測定結果(n=4，RSD≤2%)Tab.2 Determ ination resultes of hesperidin，aleanolic acid and ursolic acid in sam p les(n=4，RSD≤2%)

表3 大蜜丸和水丸齊墩果酸、熊果酸測定結果分析及服用量比較Tab.3 Content analyses and oral dose comparison of aleanolic acid and ursolic acid

表4 大蜜丸和水丸橙皮苷測定結果分析及服用量比較Tab.4 Content analyses and oral dose com parison of hesperidin

4.6 大蜜丸、水丸中橙皮苷測定結果表明，同一生產企業樣品不同批次橙皮苷定量較穩定，不同生產企業樣品之間樣品橙皮苷定量差異較大。各生產企業藥品在符合現行標準的最低要求前提下，質量存在參差不齊的情況，使得患者在服用不同生產企業藥品后療效可能出現差異。中藥成方制劑的定量測定項僅有下限控制而無上限控制，是造成不同生產企業樣品之間質量差異的原因之一。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:931-933.

［2］陳戰國，金燕子，李強.RP-HPLC測定保和丸(濃縮丸)中齊墩果酸、熊果酸的含量［J］.中國中藥雜志，2006，31(19):1630-1632.

［3］謝瑩，杭太俊，程贊.高效液相色譜法測定中藥中齊墩果酸和熊果酸含量［J］.中國中藥雜志，2001，26(9):615-616.

［4］白雪梅，付煜榮，田嘉銘.高效液相色譜法測定大山楂丸和山楂鮮果中齊墩果酸及熊果酸的含量［J］.中國醫院藥學雜志，2006，26(8):981-982.

［5］李琴韻，張雷.HPLC法測定左歸顆粒中熊果酸和齊墩果酸的含量［J］.中國中藥雜志，2005，30(4):308-309.

［6］李琦，馬俊艷.HPLC法測定大山楂丸中熊果酸的含量［J］.中國藥事，2008，22(1):54-55.

［7］劉永華.山楂葉中熊果酸的HPLC法比較分析［J］.中成藥，2005，27(3):318.

［8］梁恕坤，付慶霞，馮尚彩.HPLC法同時測定山楂葉提取物中7種主要成分［J］.齊魯藥事，2009，28(1):20-22.

［9］范志英.HPLC測定無刺枸骨不同部位中齊墩果酸和熊果酸的含量［J］.浙江中醫雜志，2010，45(2):144-145.

［10］黃秋妹，梁健華.山楂降脂片中熊果酸和齊墩果酸的含量測定［J］.今日藥學，2009，19(3):23-25.

［11］黃秋妹，李宗.HPLC法測定山楂中熊果酸和齊墩果酸的含量［J］.海峽藥學，2007，19(3):43-45.

［12］詹學雄，歐秀莉.山楂精降脂片及其原料熊果酸含量的研究［J］.海峽藥學，2009，21(1):43-46.