正交優(yōu)化超聲波法提取瓦松總黃酮工藝的研究

祝波，王亞紅

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022)

瓦松Orostachys fimbriatus為景天科瓦松屬植物，又名流蘇瓦松，全國各地均有分布，以全草入藥。始載于《唐本草》，據(jù)《中國藥典》2010年版一部記載其味酸、性平、無毒，歸肝、肺、脾經(jīng)。具有清熱解毒、止血、利濕、消腫等功效，用于吐血、鼻衄、血痢、瘧疾、痔瘡、濕疹、癰毒、疔瘡等癥［1］。現(xiàn)代藥理研究表明該植物具有抗癌、抗炎、抗菌、強心、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用［2］。國內(nèi)外學(xué)者對瓦松屬藥用植物的化學(xué)成分及生物活性進(jìn)行了一系列研究，并取得一定進(jìn)展［3-4］，瓦松主要含黃酮(flavonoids)、木栓酮(friedelin)、沒食子酸(gallic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)、胡蘿卜苷(carrot glycoside)、尿嘧啶(uracil)等化學(xué)成分，因此用途廣泛，具有藥、食兩用價值，同時也是飼料、化妝品原料與園藝花卉［5］。筆者為研究瓦松總黃酮現(xiàn)代化提取工藝，充分開發(fā)利用瓦松資源，特以主要成分總黃酮為考察指標(biāo)，采用正交實驗設(shè)計方法優(yōu)選其最佳提取工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 材料瓦松(購自吉林市江城大藥房，經(jīng)鑒定為瓦松Orostachys fimbriatus)，粉碎過40目篩備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(購自中國藥品生物制品檢定所;批號:100080-200707)。

1.2 試劑無水乙醇，甲醇，無水三氯化鋁，醋酸鈉，冰醋酸，以上試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備超聲波藥品處理機JBT/CYCL400T/3P(D)(濟寧金百特電子有限責(zé)任公司)，紫外可見分光光度計752N(上海精密儀器有限公司)，電子天平BS-600L(上海精細(xì)科技儀器廠)，移液管(北京玻璃儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)，多功能粉碎機RT-08(榮聰精密科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取110℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.5 mg，置于50 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲溶解，冷卻后定容，配制成質(zhì)量濃度為0.21 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 供試品溶液的制備稱取40目的瓦松藥材粉末5 g，置于錐形瓶中，加入60%乙醇40 mL，超聲提取(功率400 W，溫度40℃，頻率40.1 kHz，時間40 min)，過濾，濾液移入50 mL量瓶中，用60%乙醇定容，吸取1.0 mL轉(zhuǎn)移到一干燥5 mL量瓶中，用60%乙醇定溶得到供試品溶液。在提取工藝研究中，改變相應(yīng)參數(shù)。

2.3 檢測波長的確定取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL、供試品溶液1.0 mL于2個10 mL量瓶中，加入A1C13溶液(0.1 mol/L)1.0 mL，醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.5)1.0 mL，并用60%乙醇溶液定容，搖勻，靜置20 min。用試劑作空白對照，在300～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外測定，結(jié)果蘆丁供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在416 nm處均出現(xiàn)最大吸收，因此，確定測定波長為416 nm。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于6個10 mL量瓶中，加入A1C13溶液(0.1 mol/L)1.0 m L，醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.5)1.0 mL，并用60%乙醇溶液定容，搖勻，靜置20 min。用試劑作空白對照，測定416 nm波長處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸［6］，得回歸方程:y=85.00 2x+0.398 9，r=0.999 6。表明蘆丁在21～126μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 瓦松提取液中總黃酮的測定取瓦松提取液1.0 mL于5 mL量瓶中，用相應(yīng)試劑作空白對照，測定各樣品溶液在416 nm波長處的吸光度，若測定結(jié)果超出線性范圍，可先濃縮或稀釋再進(jìn)行測定。把吸光度代入回歸方程求質(zhì)量濃度，然后計算提取液中總黃酮的含有量以及總黃酮提取率，計算公式如下:

總黃酮質(zhì)量(mg)=(C×V1×V2)/(V3×1 000)

總黃酮提取率(%)=(總黃酮質(zhì)量/藥材中總黃酮的質(zhì)量)×100%

C表示所測定瓦松提取液總黃酮的質(zhì)量濃度(μg/mL);V1為制備供試品溶液時定容的體積(mL);V2為所得提取液的總體積(mL);V3為從提取液中移取的用于制備供試品溶液的體積(mL)。

2.6 方法學(xué)研究

2.6.1 精密度實驗對同一供試品溶液重復(fù)取樣，按2.4項、2.5項下方法測定、計算5次，RSD為0.78%，表明用該方法測定精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性實驗精密吸取供試品溶液1.0 mL，按2.4項下方法分別在0、20、40、60、120、180、240 min時測定吸光度，按2.5項下方法計算提取率。RSD為0.38%，顯示在4 h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性實驗準(zhǔn)確移取同一份供試品溶液，按2.4項、2.5項下方法平行測定6次、計算提取率，RSD為0.97%，表明該測定方法重復(fù)性良好。

2.6.4 加樣回收率實驗稱取已知含有量的樣品6份(質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.91%)，精密加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，按2.4項、2.5項下方法測定、計算，平均回收率為98.04%，RSD為0.67%。

2.7 單因素實驗

2.7.1 提取時間的影響準(zhǔn)確稱取5份40目的瓦松藥材5 g，置于錐形瓶中，按2.2項下方法分別在20、25、30、35、40 min超聲提取，測定吸光度，計算提取率。結(jié)果表明隨著提取時間的延長，總黃酮提取率逐漸提高，提取時間超過30 min，提取率不再增大或減小。

2.7.2 固液比的影響準(zhǔn)確稱取5份40目的瓦松藥材5 g，置于錐形瓶中，設(shè)置提取時間30 min，分別按固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入60%的乙醇溶液，研究固液比對總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明隨著固液比的增加，總黃酮提取率逐漸增大，固液比大于1∶20時，提取率增加不再明顯，基本保持原狀。

2.7.3 超聲頻率的影響準(zhǔn)確稱取5份40目的瓦松藥材5 g，置于錐形瓶中，按固液比1∶20加入60%的乙醇溶液，設(shè)定提取時間30 min，分別在超聲頻率23.7、40.1、47.6、66.6、71.6 kHz進(jìn)行超聲提取，考察超聲頻率對總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明隨著超聲頻率的增加，總黃酮提取率先逐漸增大，后減小，頻率為47.6 kHz時，提取率最高。

2.7.4 提取溫度的影響分別稱取6份40目的瓦松藥材5 g，置于錐形瓶中，按固液比1∶20加入60%的乙醇溶液，設(shè)定超聲頻率47.6 kHz，分別在40、45、50、55、60、65℃超聲提取30 min，測定吸光度，計算提取率。結(jié)果表明總黃酮提取率先逐漸增大，后減小，50℃時提取率達(dá)到峰值。

2.8 超聲提取工藝正交實驗根據(jù)單因素實驗結(jié)果，對提取時間、固液比、超聲頻率、提取溫度4個因素進(jìn)行L9(34)正交實驗，因素水平見表1，正交設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗結(jié)果

由表2直觀分析可知各因素對實驗結(jié)果影響的順序為:提取溫度＞固液比＞提取時間＞超聲頻率，最佳工藝條件為A3B2C2D1，即提取時間40 min，固液比1∶20，超聲頻率47.6 kHz，提取溫度40℃。

2.9 最佳工藝條件的驗證性實驗按最佳工藝條件提取3份各5 g瓦松粉末，測定吸光度，計算平均提取率。平均提取率為0.802%，RSD為1.65%，結(jié)果顯示優(yōu)化得到的工藝條件科學(xué)合理、具有可行性。

2.10 超聲提取與常規(guī)提取法的對比研究超聲提取按2.9項的最佳提取工藝條件進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取3份40目的瓦松藥材5 g，采用傳統(tǒng)熱水回流法提取瓦松總黃酮，提取時間4 h，提取溫度40℃，提取固液比1∶20，測定吸光度，計算平均提取率。平均提取率為0.356%，RSD為1.05%。結(jié)果見表3。

表3 兩種提取方法的比較

從表3實驗結(jié)果可知，超聲提取與常規(guī)熱水回流提取的最大差別表現(xiàn)在提取時間和提取率這兩方面。超聲提取法的總黃酮提取率比傳統(tǒng)提取法提高0.446%，所需時間大大縮短。

4 結(jié)論

將超聲技術(shù)應(yīng)用于瓦松總黃酮的提取，能夠增加黃酮類物質(zhì)的提取率。文中探討了與超聲波作用效應(yīng)相關(guān)的提取時間、固液比、超聲頻率、提取溫度4個因素對黃酮提取率的影響，同時采用正交實驗優(yōu)化最佳工藝條件。最佳工藝條件為提取時間40 min，固液比1∶20，超聲頻率47.6 kHz，提取溫度40℃。在這個最佳條件下黃酮提取率為0.802%。與傳統(tǒng)水提方法比較，超聲提取具有省時、節(jié)能、易于操作、提取率高等優(yōu)點，是一種較好的瓦松總黃酮提取新工藝。

［1］鄭萬金，仲英，孫敬勇，等.瓦松的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2009，40(6):859-862.

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［3］Kim H J，Lee J Y，Kim S M，et al.A new epicatechin gallate and calpain inhibitory activity from Orostachys japonicus［J］.Fitoterapia，2009，80(1):73-76.

［4］Je Ma C，Jung W J，Lee K Y，et al.Calpain inhibitory flavonoids isolated from Orostachys Japonicus［J］.J Enzyme Inhib Med Chem，2009，24(3):676-679.

［5］鄭萬金，張萍，仲英.瓦松屬植物的研究進(jìn)展［J］.齊魯藥事，2008，27(3):161-163.

［6］汪明禮.回歸分析在分析化學(xué)中的應(yīng)用［J］.黃山學(xué)院學(xué)報，2005(3):40-41.