大孔吸附樹脂法純化痹痛靈軟膏的工藝研究

徐偉，林靜瑜，褚克丹，陳立典*，李煌，倪峰，張小琴

(1.福建中醫藥大學，福建福州350108;2.福建省中醫藥研究院，福建福州350108;3.福建衛生職業技術學院，福建福州350108)

痹痛靈軟膏主要由雷公藤、青風藤、穿山龍、甘草四味藥物組成，為福建中醫藥大學附屬人民醫院院內制劑痹痛靈酊［1］改劑型而成，臨床用于治療風濕痹阻所致的痹病，癥見關節疼痛、腰腿疼痛、屈伸不利等，目前已申請專利(專利申請號:201110347820.4)。但在制備痹痛靈軟膏時，由于浸膏率大，且提取物中含有較多糖類以及其他雜質，不利于制劑成型。與其他常規純化方法相比，大孔吸附樹脂純化方法可明顯提高中藥制劑中有效成分的相對含有量，同時除去大量的雜質，克服傳統中成藥“粗、大、黑”的缺點，有利于制劑成型且美觀［2］。因此，本實驗選擇通過大孔吸附樹脂純化痹痛靈提取物，用蒸餾水洗去糖類等雜質，再用一定濃度的乙醇將有效成分洗脫下來，并以雷公藤總二萜內酯的含有量為指標，對大孔吸附樹脂的純化工藝參數進行優選。

1 儀器與試藥

1.1 儀器WFZ800—D3B紫外/可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);SHY—2A水浴恒溫振蕩器(江蘇金偉實驗儀器廠);XS105電子分析天平(梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 試藥雷公藤內酯醇對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111567-200502);雷公藤藥材(購自福建省漢堂生物制藥股份有限公司);D101、X-5、HPD100、DA-201、AB-8、S-8型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司);3，5-二硝基苯甲酸、氫氧化鉀(國藥集團化學試劑有限公司);其他試劑為分析純;水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 樣品制備取痹痛靈處方藥材適量，用8倍量70%乙醇加熱回流2次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，回收乙醇至無醇味，加水定容至含復方生藥量0.4 g/mL，備用。

2.2 總二萜內酯的比色法測定［3-5］

2.2.1 對照品溶液精密稱取雷公藤內酯醇對照品4.5 mg，置25 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液將各洗脫液蒸干，殘渣加無水乙醇適量使溶解，移至25 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，制得供試品溶液備用。

2.2.3 陰性對照溶液按處方配制不含雷公藤的樣品，同供試品溶液的處理方法制成陰性對照溶液。

2.2.4 Kedde顯色劑的配制根據文獻報道［1］配制1%3，5-二硝基苯甲酸醇溶液。

2.2.5 測定法根據文獻［1］，在546 nm下測定吸光度并計算，得總二萜內酯的含有量。

2.2.6 顯色反應穩定性考察根據文獻［1］進行測定，選擇在顯色30 min時測定較為穩定。

2.2.7 線性關系的考察精密吸取雷公藤內酯醇對照品溶液(181.2 μg/mL)，根據文獻［1］，配成18.12、27.18、36.24、45.30、54.36、63.42 mg/mL不同質量濃度的溶液。以相應的試劑為參比，以雷公藤內酯醇質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，在546 nm下顯色30 min時測定吸光度。得回歸方程為Y=0.032 4+0.012 7X，r=0.999 7。表明雷公藤內酯醇的質量濃度在18.12～63.42 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2.8 重復性試驗從同一樣品中精密量取6份，按2.2.5項制備方法制備，測定吸光度，RSD為1.78%，表明重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗精密量取同一批號樣品共6份，加入相應的雷公藤內酯醇對照品，按2.2.5項制備方法制備供試品溶液，測定吸光度，計算得平均回收率為99.96%，RSD為1.67%。結果符合要求。

2.3 大孔吸附樹脂純化工藝研究

2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理［6-7］大孔吸附樹脂先用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹，除去上浮的樹脂碎片和雜物，濕法裝柱，繼續用乙醇洗至流出液與水混合(1:5)不呈白色渾濁為止，然后以大量去離子水洗盡乙醇。柱內加入高于樹脂層10 cm的4%鹽酸溶液浸泡3 h，然后進行淋洗沖柱。繼續用3～4倍樹脂床體積(BV)同濃度的鹽酸溶液沖柱，然后用去離子水洗至接近中性。再用4%的NaOH溶液浸泡3 h。最后淋洗沖柱，用同濃度的3～4倍樹脂體積的氫氧化鈉溶液沖柱，最后用去離子水清洗至pH值為中性，備用。

2.3.2 樹脂型號的篩選精密稱取已處理好的各種型號樹脂D101、X-5［7］、HPD100［8］、DA-201［9］、AB-8［6］、S-8［10］適量(約相當于干樹脂1.0 g)，置100 mL錐形瓶中，分別加入供試液50 mL，放入恒溫(28℃)振蕩器中振搖24 h，振動頻率為120 r/min，充分吸附后，過濾，用50 mL水洗，再用70%乙醇洗脫，棄去水液，收集醇洗脫液，測定總二萜內酯的含有量，計算吸附量。結果見表1。由表中的結果可知，總二萜內酯在D101樹脂上的比吸附量、解吸率都明顯高于其他樹脂，這與樹脂的性質和復方中雷公藤的有效成分性質密切相關。結果與文獻［11-12］所報道采用D101進行純化分離時對樹脂的選擇結果一致。故選擇D101作為本復方的樹脂型號進行進一步的實驗。

表1 不同型號大孔吸附樹脂的吸附及解吸能力的比較

2.3.3 上樣液質量濃度確定精密量取處理好的D101濕樹脂20 mL 5份，濕法裝柱，在預試驗的基礎上準備0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/mL 5種質量濃度的樣品液，分別通過D101樹脂柱，進行動態吸附，完全吸附后，用100 mL蒸餾水洗脫后，用150 mL 70%乙醇洗脫并收集該組分，測定其中總二萜內酯的含有量，結果見表2。從表2可知，上樣液質量濃度以0.4 g/mL為宜。

表2 上樣質量濃度的確定

2.3.4 吸附體積流量確定精密量取處理好的D101濕樹脂20 mL 3份，濕法裝柱，平行準備3份樣品液，分別以不同的流速(1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h)通過D101樹脂柱，先用100 mL蒸餾水洗脫后，用150 mL 70%乙醇洗脫并收集該組分，測定其中總二萜內酯的含有量。吸附流速為1 BV/h時樹脂的吸附效果最好，但上樣速度較慢;吸附流速為2 BV/h時與1 BV/h相比，相差較小，但縮短了生產周期。因此，選擇上樣流速為2 BV/h，即每小時2倍樹脂體積量。

2.3.5 泄露曲線考察精密量取處理好的D101濕樹脂20 mL，濕法裝柱，上樣，上樣流速為2BV/h，進行動態吸附，分段收集流出液，每10 mL收集一份，測定其中總二萜內酯的含有量，并繪制泄漏曲線。如圖1。從圖1中可以看到在第11流份時的吸光度明顯增大，說明此時總二萜內酯開始明顯泄漏，所以確定樣品液最大上柱體積為110 mL，從而得出藥物的最大上樣量為44 g(生藥量)。則樹脂體積與最佳上樣量的比例為1∶2.2。

圖1 泄露曲線

2.3.6 樣品液pH值的考察精密量取處理好的D101濕樹脂20 mL(6份)，濕法裝柱，平行取6份樣品液，將樣品液分別調成pH值為2、4、7、9、10、11(其中pH值為4是樣品原液)，上樣，上樣流速為2 BV/h，吸附完全后，先用100 mL蒸餾水洗脫后，用150 mL 70%乙醇洗脫并收集該組分，測定其中總二萜內酯的含有量。見圖2。從圖中可知，pH為4的原液中的總二萜內酯含有量最高，故原藥液不調pH，直接上樣。

圖2 樣品液pH值的考察

2.3.7 洗脫劑確定精密量取處理好的D101濕樹脂20 mL，濕法裝柱，精密吸取質量濃度為0.4 g/mL的樣品液100 mL，上柱，上樣流速為2 BV/h，吸附完全后，依次用蒸餾水100 mL、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各200 mL梯度洗脫。收集各濃度的洗脫液，測定其中總二萜內酯的含有量。見表3。由表3中可知，水洗不能洗下總二萜內酯，10%乙醇即可將總二萜內酯洗脫，50%乙醇洗脫液中累計含有量最大，70%、90%乙醇洗脫液中含有很少量的總二萜內酯，故確定以50%乙醇作為洗脫劑，洗脫有效成分。

表3 洗脫劑濃度的考察

2.3.8 洗脫流速確定將上述所確定的吸附條件進行動態吸附后，樹脂柱先分別用水洗脫至洗脫液近無色，再用50%乙醇為洗脫劑，分別以1、2、3 BV/h的流速進行洗脫，收集洗脫液，測定其中總二萜內酯的含有量。洗脫流速為2 BV/h時總二萜內酯的含有量與1 BV/h相差不大，而與3 BV/h相差較大。綜合考慮，最中確定洗脫流速為2 BV/h。

2.3.9 洗脫曲線考察將上述所確定的吸附和洗脫條件，取樣品液進行上柱、吸附和洗脫，分段收集洗脫液。每個樹脂體積(濕體積)收集1份，共收集20份。測定其中總二萜內酯的含有量，據此繪制洗脫曲線，見圖3。從洗脫曲線可知，第8份洗脫液中的總二萜內酯基本已洗脫完全，所以確定洗脫劑用量為8倍樹脂體積。

圖3 洗脫曲線

2.3.10 工藝驗證實驗精密量取處理好的D101濕樹脂20 mL，3份，濕法裝柱，精密吸取質量濃度為0.4 g/mL的樣品液100 mL，上柱，上樣流速為2 BV/h，吸附完全后，依次用100 mL蒸餾水、160 mL 50%乙醇進行洗脫，收集50%乙醇洗脫組分，測定其中總二萜內酯的含有量。另精密吸取一定量置干燥至恒質量的蒸發皿中，測定浸膏的質量。結果見表4。說明痹痛靈軟膏純化工藝合理、穩定、可行。

表4 大孔吸附樹脂精制前后測定結果

3 結論與討論

3.1 大孔吸附樹脂純化痹痛靈軟膏最佳工藝為樹脂類型D101，上樣液質量濃度含生藥0.4 g/mL，吸附流速為2 BV/h，樹脂體積與最大吸附量比為1∶2.2，原藥液不調pH，洗脫劑為50%乙醇，洗脫流速為2 BV/h，乙醇用量為8B倍樹脂體積。

3.2 痹痛靈軟膏中含有雷公藤(君藥)，其有效成分雷公藤總二萜內酯為本純化工藝的考察指標。因內酯環在堿性條件水解開環，故在pH值考察中發現，隨著pH值的升高，所測得的總二萜內酯含有量明顯降低，在實驗過程中發現，pH值調高，大孔吸附樹脂洗脫后的顏色較深，說明水解后的總二萜內酯并不能很好的被洗脫下來，故本實驗中采用原液上樣即可。

3.3 中藥復方提取液中常含有大量的糖類、無機鹽、黏液質等，得到的干膏量較大，不利于制劑成型，采用大孔吸附樹脂純化提取液后，干膏率顯著降低，易于制劑成型且美觀，克服了未純化前制劑出現的有粗顆粒、不均勻細膩的缺點。

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