姜黃素單羰基類似物的體外穩(wěn)定性研究

楊蘋，隋思博，張敏，3，梁廣，梁方，李校堃，3，*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118;2.吉林省食品藥品檢驗(yàn)所，吉林長春130033;3.南京理工大學(xué)，江蘇南京210094;4.溫州醫(yī)學(xué)院，浙江溫州325035;5.大連理工大學(xué)，遼寧大連116024)

姜黃素是從中藥姜黃Curcuma LongaL根莖中提取的一種黃色酸性酚類物質(zhì)，是中藥姜黃發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、保肝、降血脂等多種藥理作用［1-3］。近年來關(guān)于姜黃素藥理作用方面的報(bào)道較多，但其在臨床應(yīng)用方面的報(bào)道卻很少，其原因是姜黃素溶液穩(wěn)定性差，在堿性溶液中易降解［4］、溶解度低、半衰期短等藥代缺陷，限制了姜黃素在臨床上的推廣應(yīng)用;姜黃素的不穩(wěn)定是因其結(jié)構(gòu)中含有不穩(wěn)定的β-二酮基團(tuán)(見圖1)。因此，我們以提高穩(wěn)定性、改善藥代缺陷為前提，以姜黃素為先導(dǎo)物，設(shè)計(jì)合成了一種去除β-二酮基團(tuán)的姜黃素單羰基類似物(見圖2)。本實(shí)驗(yàn)對合成的姜黃素單羰基類似物在不同條件下的降解速率常數(shù)進(jìn)行了測定，并與相同條件下的姜黃素進(jìn)行比較，對合成化合物的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

圖1 姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

圖2 姜黃素單羰基類似物A、B的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(日本島津公司，型號:LC-20);Hypersil ODS2 C18(日本島津公司，5 μm，4.6 mm×200 mm);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號:KQ-250DB);電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，型號:Seven Easy);漩渦混合儀(蘇州江東精密儀器有限公司，型號:XW-80A);酸度計(jì)(瑞士METTLER TOLEDO公司，型號:AB265-S);色譜純甲醇、色譜純乙腈購自Fisher公司;1640培養(yǎng)基購自GIBICO公司;胎牛血清FBS購自Hyclone公司;人血漿取自醫(yī)院健康自愿者采血;鼠血漿取自健康SD大鼠。姜黃素對照品為國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品、姜黃素單羰基類似物A 2，5-雙(2-溴苯基)環(huán)戊酮、姜黃素單羰基類似物B 1，5-雙(2-溴苯基)-1，4-戊二烯-3酮由溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院梁廣教授合成;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備精密稱取姜黃素對照品適量，加入1%的羧甲基纖維素鈉溶液(助溶)，配制終質(zhì)量濃度為50 mg/mL的混懸液，漩渦混合，使其充分溶解，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液的制備精密稱取受測化合物A、B各適量，加入1%的羧甲基纖維素鈉溶液(助溶)，配制終質(zhì)量濃度為50 mg/mL的混懸液，漩渦混合，使其充分溶解，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 緩沖溶液的配制參照文獻(xiàn)中的方法［5］配制，以磷酸二氫鈉-氫氧化鈉(pH=6.0、7.0)、碳酸-氫氧化鈉(pH=8.0、9.0、10)為緩沖體系，緩沖溶液的濃度為0.1 mmol/L，pH值分別為6.00、7.00、8.00、9.00、10.00的緩沖溶液，用酸度計(jì)進(jìn)行校正。

2.4 色譜條件及色譜圖流動相姜黃素:乙腈-水(體積比45∶55)，含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸;姜黃素類似物:乙腈-水(體積比70∶30)，含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸;檢測波長:姜黃素最大吸收波長為420 nm、姜黃素類似物最大吸收波長為361 nm;體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量為20 μL;在上述色譜條件下，進(jìn)行HPLC分析，色譜圖見圖3。

圖3 姜黃素及其單羰基類似物的HPLC圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取姜黃素及受測化合物A、B適量，加入甲醇溶液溶解并定容，配制終質(zhì)量濃度為10 mg/m L的甲醇溶液，混勻，備用。分別精密吸取不同體積的姜黃素及受測化合物A、B的甲醇溶液，加入甲醇稀釋，使其終質(zhì)量濃度分別為:100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、5 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL;過濾，取20 μL進(jìn)樣，測定其色譜峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果:姜黃素的回歸方程為:Y=215.9X－22.7，r=0.999 4，在0.25～100 μg/mL范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好;化合物A的回歸方程為:Y=130.2X+24.6，r=0.999 2，在0.25～100μg/m L范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好;化合物B的回歸方程為:Y=166.3X－47.5，r=0.999 6，在0.25～100 μg/mL范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好。

2.6 光照實(shí)驗(yàn)將配制的姜黃素溶液及受測化合物溶液分別置于不同光照條件下(室外自然光照100 000lx、室內(nèi)光照2 000lx、光照箱4 500lx)，定時取樣，處理樣品(取100 μL溶液加入900 μL的甲醇溶液定容，過濾)，20 μL進(jìn)樣，HPLC分析，分別測定其濃度，并計(jì)算出姜黃素及合成化合物A、B溶液在不同光照條件下的降解速率方程、降解速率常數(shù)k、半衰期t1/2;結(jié)果見表1，由表1可知:姜黃素及化合物溶液在室內(nèi)光照條件下最為穩(wěn)定，在光照箱中穩(wěn)定性也較好，降解較慢，但姜黃素、化合物B在室外光照的條件下，其降解速率顯著加快，而相同條件下的化合物A在室外光照條件下的穩(wěn)定性較優(yōu)于化合物B及先導(dǎo)物姜黃素。

表1 光照對姜黃素及合成化合物穩(wěn)定性的影響(n=3)

2.7 高溫試驗(yàn)將配制的姜黃素溶液及受測化合物溶液分別放入40℃、60℃的恒溫水浴鍋中保溫，定時取樣，處理樣品(樣品處理方法同2.4項(xiàng)所述)，20 μL進(jìn)樣，HPLC分析，分別測定其濃度，并計(jì)算出姜黃素及合成化合物A、B溶液在不同溫度下的降解速率方程、降解速率常數(shù)k、半衰期t1/2;結(jié)果見表2，由表2可知:姜黃素及合成化合物在溫度為40℃的環(huán)境中最為穩(wěn)定，在溫度為60℃的環(huán)境中降解較快，半衰期最短;說明在高溫條件下對姜黃素及合成化合物的穩(wěn)定性存在一定的影響。

表2 溫度對姜黃素及合成化合物穩(wěn)定性的影響(n=3)

2.8 緩沖溶液pH對姜黃素及化合物A、B穩(wěn)定性的影響

分別精密吸取配制好的姜黃素對照品及化合物A、B 5 mmol/L的甲醇溶液20 μL，加入到980 μL的不同pH的緩沖溶液中，37℃避光放置;定時取樣，處理樣品(樣品處理方法同2.4項(xiàng)所述)，20 μL進(jìn)樣，HPLC分析，分別測定其濃度，計(jì)算姜黃素及化合物A、B溶液在37℃不同pH條件下的降解速率方程、降解速率常數(shù)k、半衰期t1/2。結(jié)果表明:姜黃素及化合物呈pH依賴性，隨著緩沖溶液pH的升高，其降解速率加快;半衰期明顯縮短，其中化合物A的穩(wěn)定性較強(qiáng)，化合物B的穩(wěn)定性較弱，合成化合物A、B在堿性溶液中的穩(wěn)定性高于相同條件下的對照品姜黃素。分析結(jié)果見表3。

2.9 不同生物介質(zhì)對姜黃素及化合物A、B穩(wěn)定性的影響

分別精密吸取配制好的姜黃素對照品及化合物A、B 5 mmol/L的甲醇溶液20 μL，加入980 μL的不同生物介質(zhì)中(0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽溶液、1640細(xì)胞培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清、鼠血漿、人血漿)，37℃避光放置;定時取樣，處理樣品(前3個生物介質(zhì)的處理方法同2.4項(xiàng)所述;鼠血漿及人血漿的處理方法如下:取0.1mL混合液加入0.5 mL乙酸乙酯-三氯甲烷(9∶1V/V)處理液中，漩渦混勻，分離上層有機(jī)相，重復(fù)萃取一次，合并有機(jī)相，真空干燥，殘?jiān)尤?00 μL的甲醇溶解，過濾)，取20 μL進(jìn)樣，HPLC分析，分別測定其濃度，以時間為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)作圖(以0 h的峰面積為100%計(jì)算);分析結(jié)果見圖4，結(jié)果表明:姜黃素及合成物A、B溶液在0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽溶液、無血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基中降解較快，在含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基、鼠血漿、人血漿中降解較慢;在相同條件下受測化合物的降解率均低于先導(dǎo)物姜黃素。

表3 pH值對姜黃素及合成化合物穩(wěn)定性的影響(n=3)

3 討論

已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道［6-8］姜黃素溶液穩(wěn)定性差，在臨床前、臨床研究中表現(xiàn)出來的最大不足也是其藥代學(xué)上的缺點(diǎn)，如半衰期短、血藥濃度低、代謝過快、生物利用度低等;本實(shí)驗(yàn)研究了光照、溫度、pH值及不同生物介質(zhì)對姜黃素及合成化合物穩(wěn)定性的影響，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了姜黃素及化合物在室內(nèi)光照度為2 000lx，溫度為40℃條件下最為穩(wěn)定。

圖4 姜黃素及合成化合物在不同生物介質(zhì)中的降解曲線(n=3)

同時，實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了姜黃素單羰基類似物在溶液中呈pH依賴性，在酸性溶液及中性溶液中較為穩(wěn)定，但其在堿性溶液中極不穩(wěn)定，隨著pH值的升高，其降解速率明顯加快，半衰期縮短;同時，不同的生物介質(zhì)對其的影響也是不同的，姜黃素在0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽溶液、無血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基中降解較快，在含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基、鼠血漿、人血漿中降解較慢，說明其在體外與血漿的結(jié)合率較低，在人體內(nèi)吸收較少，而合成化合物的降解均優(yōu)于先導(dǎo)物姜黃素，其中化合物A在鼠血漿、人血漿的降解最低，在實(shí)驗(yàn)1 h內(nèi)，降解約為80%，說明其與血漿的結(jié)合率較高(還未得到進(jìn)一步的證實(shí));可能是由于化合物B與姜黃素在結(jié)構(gòu)上的類似，而使其具有與姜黃素相近的穩(wěn)定性，而化合物A可能是由于其中間連接鏈戊環(huán)產(chǎn)生位阻而使其穩(wěn)定性增加，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中對合成的姜黃素單羰基類似物A、B進(jìn)行了初步的體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，在其藥理活性方面作用廣泛，如抗氧化、抗炎、抗菌等［9-15］，但合成化合物的藥理作用及其在動物體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)、安全性評價實(shí)驗(yàn)還未得到驗(yàn)證，其應(yīng)用于臨床還有很長一段路要走，希望不久的將來，姜黃素單羰基類似物可以應(yīng)用于臨床，用于疾病的治療，為人類造福!

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