銀杏葉細粉與超微粉中總黃酮體外浸出量的比較研究

黃其春，林藝丹，林梅香，洪燕萍，楊小燕，3*

(1.龍巖學院生命科學學院，福建龍巖364000;2.預防獸醫學與生物技術福建省高等學校重點實驗室，福建龍巖364000;3.福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術中心，福建龍巖364000)

銀杏Ginkgo BilobaL.是世界上最古老的植物，為我國特有樹種，擁有量占世界總量的70%以上［1］。銀杏的藥用價值主要在其葉和果實，銀杏葉被用作藥物已有500余年的歷史，早在宋朝我國民間就使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎。現代藥理學研究表明，銀杏葉中主要有效成分為黃酮類化合物、萜類化合物和聚戊烯醇等［2-3］，其中銀杏黃酮具有擴張血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、降血脂等作用［4-5］，對治療冠心病、心絞痛、高血壓和支氣管哮喘等有顯著效果。鑒于銀杏黃酮具有獨特的藥理作用、臨床治療和保健價值，把銀杏葉黃酮類化合物開發成藥品和保健食品的研究已成為一個研究熱點，而且新的銀杏葉提取純化工藝及新的測定方法研究也越來越受人們關注。

目前，銀杏葉的提取方法主要有有機溶劑浸取法、水浸取法、超聲波提取法等［6］，其中有機溶劑浸取法應用最為廣泛。劉榮改等［7］在銀杏葉的有機溶劑提取工藝基礎上引入超微粉碎技術，結果發現超微粉碎技術能改善銀杏葉的提取工藝。黃其春等［8］以水為溶出介質，研究超微粉碎對銀杏葉中總黃酮溶出量的影響，結果發現超微粉碎能提高銀杏葉中總黃酮的溶出量。中藥經超微粉碎后，細胞的破壁率≥90%，細胞內的有效成分充分暴露出來，其釋放速度及釋放量大幅度提高，增加了中藥的體外浸出度，從而提高藥效、節約資源、降低成本，使超微粉碎技術在中藥領域顯現出特有的優勢和廣闊的應用前景［9-10］。但是，有關超微粉碎技術對銀杏葉中總黃酮在動物胃腸道中浸出的影響，還未見相關研究報道。為此，本試驗模擬胃腸道的不同pH條件，對銀杏葉細粉與超微粉中總黃酮的體外浸出情況進行比較研究，旨在為進一步開發利用我國豐富的銀杏葉資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 銀杏葉細粉和超微粉銀杏葉購自陜西中鑫生物技術有限公司，銀杏葉細粉和超微粉委托江西省千目高科有限公司制備。

1.1.2 試劑蘆丁購自國藥集團化學試劑有限公司，乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純。

1.1.3 主要實驗儀器AL104—1C電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);pH s—25數顯酸度計(上海精密科學儀器有限公司);BSD—250恒溫振蕩培養器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)和UV—3200 PCS紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 最大吸收波長的確定取少量蘆丁，用乙醇溶解后，再用原液(pH=2.23的浸出介質，見表1)定容，靜置15 min，以原液為空白，在UV-3200 PCS紫外可見分光光度計上從波長200～600 nm范圍內進行掃描，確定最大吸收波長。

1.2.2 線性關系考察銀杏葉中總黃酮量的測定采用分光光度法［11］。準確稱取經干燥至恒質量的蘆丁標準品10 mg，用10 mL乙醇溶解后，用原液定容至50 mL，配成0.2 mg/mL蘆丁標準液。分別準確吸取該蘆丁標準液0.000、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750 mL于量瓶中，用原液定容至5 mL，靜置15 min后，以蘆丁質量濃度為0.000 mg/mL的標準溶液為參比，在最大吸收波長處測定吸光度，以蘆丁質量濃度X為橫坐標，吸光度Y為縱坐標，計算標準曲線的回歸方程。

1.2.3 精密度實驗準確吸取蘆丁標準液0.5 mL于量瓶中，用原液定容至5 m L，在最大吸收波長處測定吸光度，連續測定6次，結果RSD為0.16%，說明精密度良好。

1.2.4 重復性試驗準確吸取同一批次銀杏葉超微粉浸出濾液6份，每份0.5 mL，分別用原液定容至5 mL，在最大吸收波長處測定吸光度，根據所建立的標準曲線回歸方程計算總黃酮量，結果RSD為0.50%，表明實驗重復性良好。

1.2.5 穩定性試驗準確吸取銀杏葉超微粉浸出濾液1.0 mL于量瓶，用原液定容至10 mL，在最大吸收波長處測定吸光度，每隔2 h測定1次，共測定5次，根據所建立的標準曲線回歸方程計算總黃酮量，結果RSD為0.42%，表明樣品溶液在8 h內的穩定性良好。

1.2.6 加樣回收試驗準確吸取已知總黃酮量的銀杏葉超微粉浸出濾液9份，每份0.5 mL，分別加入高、中、低3個梯度的蘆丁標準品(蘆丁加入量分別是樣品總黃酮量的80%、100%、120%，每個梯度3份)［12］，用原液定容至5 mL，在最大吸收波長處測定吸光度，根據所建立的標準曲線回歸方程計算總黃酮量，并計算加樣回收率［13］，結果平均回收率為99.90%，RSD為0.67%，表明樣品回收率良好。

1.2.7 銀杏葉中總黃酮體外浸出量的測定按表1制備原液和Ⅰ～Ⅳ號浸出介質，模擬胃腸道不同的pH條件［14］。取適量的原液于37℃恒溫振蕩器中預熱。分別稱取15 g銀杏葉細粉和超微粉于具塞三角錐形瓶中，加入30倍藥量已預熱的原液，在轉速為100 r/min、溫度為(37±0.5)℃的浸出條件下振蕩。當銀杏葉細粉和超微粉完全浸入到原液中后開始計時，按表2中的取樣時間用針頭過濾器吸取浸出液2.5 mL，隨即補充同溫度同體積的Ⅰ～Ⅳ浸出介質。取適量的續濾液，按上述方法在最大吸收波長處測定吸光度后由標準曲線回歸方程計算得出其中的總黃酮量，然后按以下公式計算出各個取樣時間點總黃酮的累積浸出量［15］。各取樣時間點總黃酮的累積浸出量(mg/g)=［Cn×b×V2+(Cn－1+Cn－2+…+C2+C1)×b×V1］/m，其中Cn為所測樣品質量濃度(mg/mL)、V2為浸出介質總體積(mL)、V1為取樣體積(mL)、b為稀釋倍數、m為樣品加入量(g)。

表1 不同pH浸出介質的組成

1.2.8 數據統計分析數據以“平均值±標準差”表示，采用SPSS13.0軟件中ANOVA模塊進行統計分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定黃酮類化合物在190～400 nm的區域內存在兩個主要的紫外吸收帶，即峰帶Ⅰ(300～400)nm和峰帶Ⅱ(220～280)nm。紫外掃描結果表明，蘆丁在波長255 nm和350 nm處均有最大吸收峰，而且在波長350 nm處吸收峰明顯。考慮到許多物質(溶劑等許多非黃酮類物質)在波長258 nm左右均有吸收，雜質干擾大，因此選擇350 nm作為測定波長。

2.2 線性關系的考察求得標準曲線的回歸方程為Y=24.971X+0.009 1，相關系數r=0.999 9，表明蘆丁溶液在0.000～0.030 mg/mL的質量濃度范圍內，其質量濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.3 銀杏葉中總黃酮的浸出量銀杏葉中總黃酮的浸出量見表2。由表2可知，在模擬胃腸道的浸出介質中，銀杏葉細粉和超微粉中總黃酮的累積浸出量隨著浸出時間的增加而增加。在浸出的起始階段(15～180 min)，銀杏葉細粉和超微粉中總黃酮均有一個較快的浸出過程，隨后總黃酮的浸出速度逐漸減慢，銀杏葉細粉中總黃酮在4 h后基本不再浸出，銀杏葉超微粉中總黃酮仍有少量浸出。在各個取樣時間點，銀杏葉超微粉中總黃酮的累積浸出量均顯著高于銀杏葉細粉中總黃酮的累積浸出量(P＜0.01)，其增加幅度達7.4%～21.7%。

表2 銀杏葉細粉和超微粉在不同取樣時間點總黃酮的累積浸出量

3 討論

目前，超微粉碎技術在中藥領域已顯現出特有的優勢，并廣泛應用于中藥生產。劉榮改等［7］、黃其春等［7］分別報道超微粉碎技術能改善銀杏葉的提取工藝、提高銀杏葉中總黃酮的溶出量。但是，有關超微粉碎技術對銀杏葉中總黃酮在動物胃腸道中浸出的影響還未見報道。本試驗模擬胃腸道的不同pH條件，對銀杏葉細粉與超微粉中總黃酮的體外浸出情況進行了比較研究。為更好地模擬藥物在胃腸道中的轉運情況，除配制不同pH值的緩沖液作為浸出介質外［14］，取樣時間的設定主要是參考藥物在胃中(pH 2.23～4)停留約2 h，小腸中(pH 7.4左右)停留約4 h，大腸中(pH 7.8以上)停留約2 h而確定的。前4 h pH變化大，取樣間隔為15 min;后4 h pH變化小，取樣間隔為30 min［16］。試驗結果表明，在模擬胃腸道的浸出介質中，銀杏葉細粉和超微粉中總黃酮在起始的15～180 min浸出較快，前4 h(pH 2.23～6.96)的浸出量較多。而在后4 h(pH 7.06～8.5)，銀杏葉細粉中總黃酮基本不再浸出，銀杏葉超微粉中總黃酮仍有少量浸出。在各個取樣時間點，銀杏葉超微粉中總黃酮的累積浸出量均顯著高于銀杏葉細粉中總黃酮的累積浸出量(P＜0.01)。究其原因，可能與銀杏葉細粉和超微粉細胞壁完整性、粒徑以及比表面積大小有關。銀杏黃酮等有效成分主要存在于銀杏葉的細胞質中，在細胞壁完好的情況下，黃酮等有效成分需經過浸潤、溶脹、滲透和擴散等過程，方能從細胞質中穿過細胞膜和細胞壁擴散到浸出介質中，這一過程進行的比較緩慢，而且不能進行完全。銀杏葉經過超微粉碎后，難以看到完整的細胞結構，細胞破壁率很高，粒徑變小，比表面積增大［8，17］，這不僅使黃酮等有效成分充分暴露出來，其浸出不受細胞膜和細胞壁的阻礙，直接溶解到浸出介質中，而且還使黃酮等有效成分與浸出介質間的有效接觸面積增大，浸出介質進入顆粒中心的距離縮短，進而導致黃酮等有效成分浸出速度加快，浸出量增加，該過程進行很快，而且比較徹底。

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