柱前衍生高效液相色譜法測定新疆金雞菊中游離氨基酸

馬曉麗，趙東升，孫自增，李新霞，毛新民

(1.新疆醫科大學分析測試中心，新疆烏魯木齊830000;2.新疆醫科大學中醫學院，新疆烏魯木齊830000)

金雞菊Coreopsis basalis又名昆侖雪菊，屬菊科金雞菊屬Coreopsis的干燥頭狀花序［1］。目前在新疆和田地區種植較為廣泛，是維吾爾族世代傳承下來的一種養生、保健的天然植物。新疆維吾爾醫院也將其作為一種維藥材應用，民間將其當茶飲用，有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效。藥理實驗也證明新疆金雞菊對冠心病、高血脂、糖尿病均有特殊的療效［2-4］。

據文獻報道，金雞菊中主要含有黃酮、揮發油、多糖和氨基酸等活性成分，目前還沒有金雞菊質量控制的藥材標準，文獻［5］采用氨基酸自動分析儀分析了新疆金雞菊中總氨基酸的含有量，但該方法所用試劑量大、測試成本較高，且分析得出的是蛋白水解后的氨基酸含有量，缺乏準確性。近年來高效液相色譜法成為檢測氨基酸的重要方法［6-8］，本實驗采用柱前衍生高效液相色譜法分析新疆金雞菊中主要游離氨基酸的含有量，嘗試通過對其中多種游離氨基酸進行檢測來評價新疆金雞菊藥材的質量，為新疆金雞菊中氨基酸成分的研究提供參考。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Waters e2695，UV-2489紫外檢測器，色譜柱(Shim-pack VP-ODS，4.6 mm×25 cm，5 μm)，Empower 3色譜工作站;分析天平(Sartorius，BS110S，d=0.1 mg);氮吹儀(天津恒奧科技，HSC-12A);快速混勻器(金壇市醫藥儀器廠，SK-1)。

氨基酸對照品天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Aspa)絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)色氨酸(Trp)、賴氨酸(Lys)(生化試劑，純度均大于98%)乙酸鈉(天津市光復精細化工廠，優級純);正己烷、三乙胺(TEA)(天津市富宇化工有限公司，分析純);異硫氰酸苯酯(PITC)(上海金山亭新化工公司);乙腈和甲醇為色譜純;milli-Q超低有機物超純水機制備超純水(美國Millipore公司生產)。

金雞菊樣品采自新疆和田地區，由新疆雪菊生物科技公司提供，經新疆醫科大學藥學院胡君萍博士鑒定。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液配制分別精密稱取18種氨基酸對照品適量，置于同一25 mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶解并定容至刻度，作為氨基酸貯備溶液。

2.1.2 供試品溶液配制精密稱定和田地區金雞菊樣品粉末(40目)約2.0 g。加水40 mL，浸泡1 h，100 kHz 60℃超聲提取30 min，過濾，濾渣同上方法再次提取，過濾，合并濾液，低壓旋轉濃縮后定容至50 mL，得質量濃度為0.04 g/L的供試品溶液。

2.2 衍生化反應

2.2.1 衍生化試劑配制

1 mol/L三乙胺乙腈溶液∶取三乙胺1.3 mL，加乙腈定容至10 mL量瓶中，混勻備用。

0.1 mol/LPITC乙腈溶液:取PITC 0.3 mL，加乙腈定容至25 mL量瓶中，混勻備用。

2.2.2 對照品和供試品衍生化取對照品溶液和供試品溶液200 μL，加入0.1 mol/L PITC乙腈溶液100 μL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL，渦旋混勻，室溫放置20 min，加入正己烷500 μL，充分震搖混勻后，10 000 r/min離心5 min，分層后，吸取下層溶液(正己烷萃取2次)，用0.45 μm濾膜濾過，備用。以水作為陰性對照溶液，同法進行衍生。

2.3 色譜條件色譜柱:Shim-pack VP-ODS色譜柱(4.6mm×25 cm，5 μm，島津);流動相A:稱取15.2 g無水乙酸鈉，加水1 850 m L，溶解后用冰醋酸調pH值6.5，然后加乙腈140 mL，混勻，用0.45 μm濾膜過濾。流動相B:甲醇-乙腈-水=(20∶60∶20)，梯度洗脫見表1;體積流量:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm柱溫:35℃;進樣量:10 μL。

表1 梯度洗脫程序

取衍生化后的對照品、樣品及陰性對照溶液進樣測定。根據保留時間可見新疆金雞菊中主要氨基酸。各氨基酸的理論塔板數均不低于5 000。

3 結果與討論

3.1 專屬性考察在上述色譜條件下進樣分析，標準溶液、樣品色譜圖見圖1(A、B、C)。由圖可見18種氨基酸在35 min內基本達到了完全分離，內源性物質和衍生化試劑不干擾氨基酸的測定。

圖1 HPLC色譜圖

3.2 線性考察分別精密量取氨基酸混合對照品溶液0.20、0.5、1、2、3、4、5 mL各置10 mL量瓶中，用水定容至刻度，得到7種不同質量濃度的氨基酸對照品混合溶液。按照2.2項下衍生后測定，記錄色譜圖。以進樣質量濃度C為橫坐標，進樣峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。結果見表2。

表2 18種氨基酸的線性方程

3.3 方法的精密度、重復性及穩定性試驗取對照品溶液200 μL，按照2.2.2項方法衍生后連續進樣5次，以及分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，以色譜峰峰面積為指標計算RSD，考察其精密度和穩定性，18種氨基酸標準溶液的精密度試驗RSD在0.26%～3.43%(n=5);衍生產物穩定性試驗RSD在2.28%～3.58%(n=5)。取同一批金雞菊干燥粉末5份，按2.1.2項方法提取、2.2.2項下衍生、測定，以色譜峰峰面積為指標分別計算RSD，考察方法的重復性，各氨基酸峰面積的RSD在2.85%～3.97%。

3.4 回收率試驗精密稱取已知含有量的同一批次金雞菊樣品6份，準確加入一定量的氨基酸混和標準溶液，按照2.2.2項方法衍生、進樣，外標法定量，平行5次，計算各氨基酸的回收率和RSD。樣品測定結果表明，由于樣品中只有12種氨基酸被準確檢出并定量，因此本實驗只計算了12種氨基酸的平均回收率，在94.08%～105.3%之間;RSD在0.96%～2.97%。結果見表3。

3.5 樣品測定取衍生好的樣品溶液200 μL，按照上述的色譜條件進行測定，外標法定量，樣品測定結果表明，新疆金雞菊中的游離氨基酸主要以脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸為主，占游離氨基酸總量的79.2%，其次是胱氨酸、絲氨酸、纈氨酸等，樣品中谷氨酸、組氨酸、絡氨酸、蛋氨酸未達到檢出限，而苯丙氨酸在線性以下，未能定量。結果見表4。

表3 樣品中各個氨基酸的加標回收率(n=5)

表4 不同地區氨基酸質量分數(n=3)

4 討論

氨基酸柱前衍生主要采用的衍生化試劑有異硫氰酸苯酯(PITC)和鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde，OPA)、丹酰氯等，根據本組的預實驗發現OPA衍生法雖然快速，但衍生產物極不穩定，很容易降解，而丹酰氯法需要水浴反應，較麻煩。因此本實驗采用異硫氰酸苯酯進行氨基酸的衍生，反應生成苯氨基硫甲酰衍生物(phenylthiocarbamylaminoacide，PTC-AA)，本方法靈敏度高，衍生化產物穩定、單一，衍生試劑雜質峰不干擾測定，結果18種氨基酸對照品在35 min內能夠完全分離，適用于新疆金雞菊中游離氨基酸的快速測定。

本實驗考察了不同流動相梯度比例，不同反應時間及不同萃取次數對衍生產物的影響，結果根據色譜柱情況調整了梯度比例后，可以有效的分離各氨基酸，本實驗同時考察了不同衍生時間對測定的影響，發現室溫衍生20 min、30 min及1 h對衍生產物峰面積影響不大，因此選用室溫反應20 min對氨基酸進行測定，還考察了多次溶劑萃取對衍生產物的影響，由于衍生試劑對色譜柱有一定的損害，當用正己烷進行多次萃取后發現萃取次數對氨基酸的峰面積影響不大，但可以有效減少衍生試劑的殘留，同時可以減少其對色譜柱的損害，延長色譜柱的使用壽命，因此最后本實驗選用樣品與衍生試劑室溫反應20 min，正己烷萃取2次后進樣分析測定。

本實驗對新疆不同地區的金雞菊中游離氨基酸含有量進行了測定，結果發現含有量最高的氨基酸為脯氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸，三者之和占到總氨基酸量的76.05%～79.41%;不同地區的金雞菊中氨基酸含有量稍有差異，根據結果新疆和田的皮山地區金雞菊中游離氨基酸含有量均較高，可能與該地區地理位置，種植品種(系)及生態環境尤其其海拔有一定關系。本方法準確，可靠、經濟，能用于新疆金雞菊藥材中氨基酸的測定。

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