煙草突變體篩選與鑒定方法篇：6.煙草T-DNA激活標簽突變體側翼序列篩選與鑒定

崔萌萌

（中國農業科學院煙草研究所，青島 266101）

通過激活標簽技術（activation tagging）得到突變群體是構建突變體庫的一種重要方法，應用此種方法研究基因功能，不管是用正向或反向遺傳學方法，都必須先獲得插入位點的側翼序列（flanking sequence）。隨著擬南芥、水稻及煙草等作物的側翼序列數據庫的不斷完善及煙草全基因組測序的完成，越來越體現出激活標簽技術對于推動煙草功能基因組學研究具有巨大的潛力。

1 T-DNA激活標簽插入群體構建

T-DNA激活標簽技術是從早期的T-DNA標簽技術發展改良而來的，早期的T-DNA標簽技術是將人工構建的T-DNA通過Ti或Ri質粒攜帶，用農桿菌介導的方法[1]隨機插入到植物基因組中，通常得到的是功能缺失型突變體，并不適于功能冗余基因、多發育階段作用基因、環境變化相關基因的研究。T-DNA激活標簽是在 T-DNA的邊界加入強啟動子或多個串聯增強子，從而增強插入區附近（上游或下游）基因的表達，產生顯性功能獲得型（dominant gain of function）突變體，且這種突變是可穩定遺傳的。通過對激活標簽載體T-DNA區加入篩選標記（如抗除草劑Basta的Bar基因和抗卡那霉素的nptH基因）[2]可以篩選陽性植株。當激活標簽插入到基因內部時也會產生傳統插入失活突變體。2012年采用葉盤轉化法通過農桿菌侵染將激活標簽載體pSKI015轉入煙草品種紅花大金元中，獲得了具有Basta抗性的轉基因突變體T0代近4萬份。

2 激活標簽突變體的初步篩選

由于通過激活標簽技術產生的功能獲得型突變體表型為顯性，所以在當代即可進行初步的表型篩選，通過觀察得到一些外觀性狀明顯的突變表型；香氣、煙堿等性狀突變需要專業人員進行分析或測定；一些肉眼不可見的形態突變要借助顯微觀察等方法。

3 側翼序列的篩選

激活標簽插入突變體側翼序列篩選一般通過以下步驟進行：（1）突變群體基因組DNA提取、DNA定性及定量分析；（2）DNA 樣品的陽性檢測；（3）側翼序列擴增；（4）瓊脂糖電泳檢測；（5）特異性側翼序列擴增產物測序分析。

激活標簽突變體側翼序列擴增的方法主要有：熱不對稱交錯 PCR法（thermal asymmetric interlaced-PCR，TAIL-PCR）[3-4]，PCR 步移（PCR-walking）[5]，FPNI-PCR[6]等。

TAIL-PCR方法的原理是根據激活標簽載體T-DNA區的左邊界設計3個嵌套的特異性引物，用它們分別與低Tm值的隨機簡并引物結合，第一輪反應以基因組DNA為模板，根據引物長短和特異性的不同設計熱不對稱的循環，通過分級反應來得到特異性產物。

PCR-walking方法是利用產生平滑末端的限制性內切酶（轉基因元件里不應存在酶切位點）消化基因組DNA，并與設計好的接頭相連接，設計T-DNA特異性和接頭特異性的引物進行第一輪PCR擴增；再用一對嵌套的特異性引物進行第二輪PCR擴增，從而獲得特異性的擴增產物。

FPNI-PCR方法通常需要三輪反應，第一輪反應和TAIL-PCR一樣運用熱不對稱原理，第二和第三輪反應運用高嚴謹性循環選擇性地擴增出特異性產物。

4 突變基因功能鑒定

農桿菌介導的激活標簽插入在轉基因植物中多為單拷貝，且能穩定遺傳，通過實驗確定其是單拷貝后那正常情況下它就是導致插入突變的突變原[7]，其后代符合孟德爾遺傳定律。從突變群體中篩選到具有突變表型的株系后，通過T-DNA插入序列設計引物進行PCR檢測，初步判斷突變性狀是否與插入事件共分離，再通過側翼序列與突變性狀的共分離檢測來確定突變是否是由 T-DNA插入引起的。測序獲得目標株系插入位點的側翼序列信息，通過與數據庫中的數據比對來判斷激活標簽的插入位點，確定候選基因[8]。通過將候選基因的野生型拷貝轉化入突變株進行過量表達，觀察其表型恢復情況，或采用RNAi等方法進行基因功能驗證。為保證遺傳分析的準確性，每代每個株系群體應保持相應的數量，由于激活標簽法產生的是顯性功能獲得型突變體，純合體的獲得需要多年自交篩選。

激活標簽技術已經在擬南芥和水稻中得到了廣泛的應用，在煙草中也有成功的應用。Hayashi等[9]首先在煙草中成功使用帶有4個CaMV35S增強子[10]的激活標簽，得到了不需要外源生長素就可以生長的愈傷組織突變體。Weigel等[2]用T-DNA激活標簽技術創建擬南芥突變群體，分析鑒定了30個不同表型的顯性突變體，RT-PCR表明插入位點附近的基因過量表達。Jeong等[11]構建了一個T-DNA中含有CaMV35S增強子的質粒載體pGA2715，并用該載體構建了含有13 450個獨立的水稻T-DNA插入標簽系，反轉錄PCR分析表明，約40%的T-DNA插入株系中與插入位點相鄰的基因表達明顯增加，但不一定能產生明顯的表型變化。

5 問題與展望

整合到基因組的 T-DNA一旦出現多拷貝插入，就會對基因分離和性狀分離造成麻煩，而且組培過程中也會產生突變，這些都增加了基因功能的分析難度。有研究表明，T-DNA并不是完全隨機插入，而是優先插入到轉錄活躍的區域[12]，且在某些情況下由激活標簽引起的表型經過幾代會消失，這可能是由于插入的T-DNA或者側翼序列甲基化導致的[13-14]。雖然存在著一些問題，但T-DNA激活標簽法還是植物基因功能研究的一個極具潛力的研究方法。

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