SOCS1調控未成熟樹突細胞分化誘導肝移植免疫耐受及機制研究

于曉春 羅時敏 黃昭 楊智 程園園 劉繼云

SOCS1調控未成熟樹突細胞分化誘導肝移植免疫耐受及機制研究

于曉春 羅時敏 黃昭 楊智 程園園 劉繼云

目的 探討細胞因子信號傳導抑制因子-1（Suppressors of cytokine signaling-1,SOCS1）基因腺病毒轉染未成熟的樹突細胞（Dendritic cells，DC），并免疫受體小鼠，通過小鼠肝移植模型，觀察免疫耐受的效果并探討可能的機制。方法 構建SOCS1腺病毒并PCR鑒定，感染體外分離、培養的小鼠骨髓樹突細胞，Westernblot法檢測SOCS1表達。以未轉染組及空白轉染組為對照，免疫肝移植小鼠模型，檢測受體小鼠脾臟淋巴細胞混合淋巴細胞反應（MLR），檢測血清IL-2和IFN-γ水平及肝臟組織IL-2和IFN-γmRNA表達。結果 成功構建并鑒定轉染腺病毒，感染DC后，SOCS1蛋白表達水平較未轉染組及空白轉染組顯著增高（P＜0.05）。SOCS1基因修飾的DC免疫肝移植模型小鼠后，受體小鼠脾臟淋巴細胞MLR較未轉染組及空白對照免疫受體組小鼠顯著下降（P＜0.05）；SOCS1-DC免疫受體小鼠血清IL-2和IFN-γ水平及肝臟mRNA表達水平均顯著下降（P＜0.05）。結論 通過腺病毒轉染使SOCS1在DC中過度表達，用以體內免疫同種異體肝移植受體小鼠，能有效減輕同種移植排斥反應，并在一定程度上誘導形成免疫耐受。

細胞因子信號傳導抑制因子-1；樹突狀細胞；肝移植；移植物排斥

器官移植術后排斥反應是影響移植物功能及收者生存質量的重要因素之一[1]。近年來，多種新型免疫抑制劑的臨床應用，雖然降低了器官移植排斥反應的發生率，但過度抑制了機體免疫[2]。因此，有效的抑制同種移植排斥反應，并保持機體正常的免疫力是解決移植排斥的有效辦法。近年研究發現，髓系未成熟樹突狀細胞亞群(immature DC subset，imDC)由于表面粘附輔助分子如B7、CD40等缺乏，則具有免疫耐受性，可以誘導T細胞失能、低反應型以及Th2細胞極化，并且誘導調節性T細胞產生，對于器官移植的免疫穩態的維持具有重要的作用[3]。細胞因子信號傳導抑制因子（Suppressor of cytokine signaling-1，SOCS1）是近年來發現的一類與細胞因子JAK-STAT信號傳導途徑有關的負性調節蛋白，能夠抑制白介素、IFN等多種因子的細胞內信號傳導[4-5]。本實驗采用基因轉染技術上調DC內的SOCS1的表達，并免疫受體小鼠，通過小鼠肝移植模型，觀察免疫耐受的效果并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞系 供體C57BL/6小鼠、受體BALB/C小鼠，6～8周，體重20～22g（上海必凱實驗動物有限公司），293細胞株購（上海中科院細胞研究所）。

1.2 主要試劑 RPMJ-1640和胎牛血清（Gbico公司，美國），LPS（Sigma-Aldrich公司，美國），引物（上海生工生物技術公司）；RNA逆轉錄試劑盒（TOYOBO公司，日本）；SOCS1、β-actin蛋白印跡試劑盒（Cell Signal公司，美國），小鼠白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素12(IL-12)、ELISA檢測試劑盒（Biotec公司，美國）。

1.3 腺病毒載體 編碼SOCS1基因的復制缺欠病毒載體（Ad-SOCS1）及空白對照腺病毒Ad-GFP病毒（北京本元正陽基因技術有限公司）。

1.4 重組腺病毒的擴增、純化和滴度測定 用已獲得的重組病毒大量感染293細胞，當293細胞出現細胞病變效應開始脫落時，收獲病變細胞及培養液，3000r／m、5min離心兩次棄上清，并在-70℃和37℃反復凍融3次，每次30min，4℃ 3000r／m離心5min，收集上清。按試劑盒說明純化病毒。OD260法測定病毒顆粒滴度（VP/mL），TCID50法測定病毒感染滴度（IU/mL）。

1.5 重組腺病毒感染小鼠DC 頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，無菌切取脛骨、股骨，PBS沖出骨髓細胞，Tris-NH4Cl低滲裂解紅細胞后，用含10% FBs的RPMI-1640培養液重懸細胞，調細胞濃度為1×106/mL，加入rmGM-CSF(10ng/mL)，接種于24孔培養板，去除懸浮的粒細胞，第5d收集半貼壁細胞(DC)用復合感染指數(MOI)為1:100的重組病毒Ad-SOCS1及Ad-GFP感染DC，未經病毒轉染的骨髓DC作為對照。感染后18h，吸盡含病毒的培養液，更換含rmGM-CSF的完全培養基繼續培養，6h后收獲細胞。以上三組細胞分別稱為DC-SOCS1、DC-GFP及imDC，用于后續試驗。

1.6 Western Blotting檢測Ad-SOCS1對DC的轉染效果 各組細胞1×107/mL，收集細胞蛋白，并測定樣品蛋白含量。等量蛋白樣品經10%的SDS-PAGE分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉4℃過夜，加一抗室溫搖晃2h，加辣根過氧化物酶標記的二抗(1:5000，Sigma)室溫搖晃1h，以上各步驟間用TBS (tween-tris-bufered saline solution)洗10min×3次。暗室內增強的化學發光反應顯色，X線底片曝光、顯影、定影，底片用凝膠圖像分析儀CheniImager5500 V2.03軟件掃描，用Fluor Chen2.0軟件進行定量分析得到光密度值(Optical density，OD)。

1.7 小鼠分組及處理 (1)受體小鼠分成4組，每組8只。移植前7d，3組小鼠分別經靜脈注入2×106個供體來源imDC、DCGFP及DC-SOCS1，等量PBS注入的受體小鼠作為空白對照。4組小鼠接受原位肝移植；(2)原位肝移植：采用雙袖套法，供體異氟醚麻醉，上腹部全橫切口進腹，切除膽囊，完全游離門靜脈至腸系膜上靜脈水平，停止異氟醚麻醉，IVC注入生理鹽水，斷肝動脈，取出游離肝臟，放入4℃ UW培養液中。受體手術切除肝臟采用類似方法，植入供肝，各血管袖套吻合，膽管內置供體膽管支撐管。第14d處死動物并檢測免疫學指標。

1.8 血清IL-2和IFN-γ的檢測 肝移植術前及術后第14d，取受體外周血，應用ELISA法檢測IL-2和IFN-γ的水平。

1.9 受者脾臟細胞同種混合淋巴細胞反應（MLR）檢測移植14d收獲脾臟，制備淋巴細胞懸液，2.5:1、5:1、10:1、20:1的比例與γ射線面或C57BL/6脾淋巴細胞混合，培養3d。液閃計數儀檢測[3H]-TdR。

1.10 移植肝臟內IL-2和IFN-γmRNA表達的測定 提取肝組織的mRNA，按試劑盒說明書進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，用凝膠成像系統照相，以Bio-Image Analysis System進行半定量分析，計算目的條帶吸光度(A)值與內參區帶A值的比值，作為目的mRNA的相對含量。

1.11 統計學方法 所有數據采用SPSS13.0統計學軟件進行處理，實驗數據用均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用χ2分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組腺病毒的滴度 病毒顆粒滴度為1.7×1011VP/mL，病毒感染滴度為1.9×109IU/mL。

2.2 SOCS1基因轉染DC細胞后SOCS1蛋白的表達 Ad-SOCS1轉染后的DC細胞較Ad-GFP轉染組及未轉染組的SOCS1蛋白表達顯著增高，從而表明Ad-SOCS1轉染有效，明顯上調了轉染樹突細胞內SOCS1基因的表達，如圖1。

2.3 各受者小鼠脾臟MLR采用MLR方法檢測各組小鼠免疫系統的影響 imDC和DC-GFP組小鼠的脾臟淋巴細胞對供者抗原刺激反應無明顯區別，與空白組比較有一定程度下降，但這種差異無統計學意義（P=0.051），而DC-SOCS1組與imDC和DCGFP組小鼠比較，脾臟淋巴細胞對供者抗原刺激反應則進一步降低（P＜0.05），與空白組比較更有顯著下降（P＜0.01），如圖2。

2.4 肝移植術前及術后血清IL-2和IFN-γ水平 肝移植術后各組血清IL-2和IFN-γ水平均無明顯差異（P＞0.05），而移植術后各組小鼠血清IL-2和IFN-γ水平均較術前顯著增高（P＜0.05）；但SOCS1-DC組小鼠兩種細胞因子與空白組及其他對照組比較顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），如圖3。

圖1 各組細胞內SOCS1的表達。

圖2 各組受體小鼠脾臟淋巴細胞混合反應。

2.5 肝臟內IL-2和IFN-γmRNA表達 肝移植術后imDC和DC-GFP組受體小鼠肝臟組織IL-2和IFN-γmRNA表達水平與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而DCSOCS1組兩種細胞因子的mRNA表達則顯著下降（P＜0.05），如圖4。

3 討論

樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是惟一能夠激活初始T細胞反應的抗原遞呈細胞，是決定T細胞反應狀態的重要因素[7]。研究表明，DC是一類異質性細胞群體，成熟DC因其表面高表達CD40、CD80等共刺激分子，因而能激活T細胞，誘導免疫應答，表現出免疫原性；而未成熟DC表面不表達或者低表達共刺激分子，提呈抗原時因缺乏共刺激信號而誘導T細胞無能或凋亡，因而傾向誘導免疫耐受，表現出耐受原性[8]。近年來，較多研究嘗試多種方法抑制DC成熟，并利用這種不成熟DC回輸體內誘導耐受，從而延緩或組織移植排斥反應，這也是器官抑制領域研究的熱點之一[9]。SOCS1作為JAK-STAT信號途徑的負性調節因子，其對DC的成熟以及功能的調控以及引起研究者的廣泛注意。有研究發現，通過RNA感染技術沉默DC內的SOCS1基因，可以增強DC的抗原呈遞功能，并增強腫瘤抗原特異性的抗腫瘤免疫反應[10]。本研究采用轉基因技術上調DC中的SOCS1基因表達，以期能有效抑制DC的成熟而增強免疫耐受原性。

圖3 各組小鼠在手術前后血清IL-2和IFN-γ水平。

圖4 各組小鼠在手術前后肝臟組織IL-2和IFN-γmRNA表達。

筆者通過骨髓細胞體外條件培養法，分離獲得了較高純度的未成熟DC，并利用SOCS1基因的腺病毒轉染DC后，通過蛋白鑒定發現轉染后的DC顯著高表達SOCS1蛋白，因此提示通過腺病毒轉染SOCS1基因在DC中高表達的方法是可行的。通過進一步將SOCS1基因高表達的DC細胞注入接受同種肝移植受體小鼠體內，并分析其免疫功能，結果發現DC-SOCS1免疫受者后，脾臟淋巴細胞對同種抗原的MLR活性顯著降低，提示受者淋巴細胞對同種抗原的反應活性明顯下降，從而為介導移植排斥反應的免疫耐受、延長移植物存活期提供了基礎[11]。

大量實驗表明，在排斥反應發生過程中常伴有Th1型細胞因子(如IFN-γ、IL-2)的表達增高和Th2型細胞因子(如IL-4、IL-10)的不表達或低表達，而在免疫耐受時，則呈相反的情況。IFN-γ不僅可以促進Th型細胞分化為Th1型，同時通過誘導促炎癥因子分泌，激活炎癥細胞釋放各種效應因子從而促進排斥反應，而IL-2作為重要的促炎癥因子，也在排斥反應中起到了重要的作用。本研究顯示，同種異體肝移植術后，受體小鼠血清中IFN-γ及IL-2含量及在肝臟組織mRNA表達均較術前顯著增高；而SOCS1-DC免疫的受體小鼠，較對照組及空白組血清中IFN-γ及IL-2含量及在肝臟組織mRNA表達均有顯著的下降，因此提示SOCS1基因修飾的DC免疫治療在一定程度上成功誘導了免疫耐受，從而有望進一步提高移植物存活率，這與以往體外研究中的結果也是相一致的[12]。

綜上所述，筆者的研究結果表明，SOCS1基因修飾的DC，用以體內免疫同種異體肝移植受體小鼠，能有效減輕同種移植排斥反應，并在一定程度上誘導形成免疫耐受。因此，進一步基于SOCS1基因修飾的DC免疫治療策略對于誘導抑制免疫耐受具有重要的意義，也具有潛在臨床應用價值。

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Objective To study the effect on immune tolerance in heterotopic liver transplantation mode mice of Cytokine Signaling-1 (SOCS1)gene modifi ed dendritic cells (DC). Methods The adenovirus vectors containing suppressors of cytokine signaling-1 (SOCS1) was constructed.BALB/c mice was immunized with imDC, DC-GFP and DC-SOCS1, the serum level and the mRNA expression in liver of IL-2 and IFN-γ was detected. And mixture lymphocyte reaction (MLR) in spleen lymphocytes was observed in BALB/c mice. Results The adenovirus vectors containing SOCS1 was successfully constructed and tranfected. BALB/c mice immunized by DC-SOCS1 exhibited low reactive in spleen lymphocyte MLR (P＜0.05). Serm IL-2 and IFN-γ levels determined by ELISA in the DC-SOCS1 group increased signifi cantly after liver allograft transplantation,but was lower compared to control group and imDC,DC-GFP group (P＜0.05). The semiquantitative reversed transcriptase polymerase chain reaction assay showed that expression levels of IL-2 and IFN-γ in DC-SOCS1 mice also decreased markedly compared with other groups (P＜0.05). Conclusion Replication defective adenovirus vector SOCS1 can effectively transfect DC, and increase the expression of SOCS1 gene. Immunization with SOCS1 gene modifi ed immature DC in vivo can induce antigen-specifi c immune tolerance in organ transplantation.

Suppressors of cytokine signaling-1 (SOCS1); Dendritic cells; Transplantation; Graft rejection

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.25.001

廣東省科技計劃基金資助項目 (2010B031600014)

510180 廣州市第一人民醫院危重癥監護中心 （于曉春 羅時敏 黃昭 楊智 程園園 劉繼云）