結直腸癌CD133+細胞定量評估的意義

繆 剛 李 堯 趙艷陽 黃美雄 韋軍民

越來越多的證據表明腫瘤中存在腫瘤干細胞(cancer stem cells)，并且其與腫瘤的增殖、轉移、復發和對化療不敏感關系密切。CD133被確認為最好的獨立結直腸癌干細胞標志物，并且可以通過對結直腸癌CD133+細胞表達來預測患者的生存期［1］。這說明CD133不但可以在篩選腫瘤干細胞以及靶向性或選擇性殺傷腫瘤干細胞中發揮重要作用，還可以成為結直腸癌患者的一個重要預后指標。本研究取材于手術中切除的新鮮結直腸癌組織標本，提取具有活性的原代結直腸癌單細胞進行流式細胞分析。在準確定量評估后發現CD133+結直腸癌干細胞的表達與腫瘤增殖能力和腫瘤轉移相關蛋白的表達相關。這為臨床結直腸癌干細胞的準確定量檢驗提供了方法和依據。

材料與方法

1.腫瘤組織取材:結直腸癌組織直接來源于手術切取標本(術前經纖維結腸鏡活檢病理確認)。標本離體后迅速切開腸道，用0.9%生理鹽水沖洗后切取腫瘤邊緣約1cm×2cm大小非壞死組織。癌組織經5次清洗液(青霉素1mg/ml、卡那霉素0.5mg/ml、兩性霉素2.5μg/ml的生理鹽水)清洗后，存放入4℃保存液(5%FBS的DMEM，抗生素劑量同清洗液)備用。相關操作程序經北京醫院倫理委員會審核通過。

2.原代結直腸癌細胞提取:腫瘤組織進入實驗室無菌操作臺。經細胞清洗液(Hanks液，抗生素劑量同前)清洗3次后將組織剪碎，然后用刀片將組織切至稠液狀。將組織用9ml清洗液清洗收集入50m l離心管，加入1%collagenase 1ml (type I，Invitrogen corporation)后放入37℃培養箱震蕩消化60min。消化后組織液經清洗離心，然后用60目篩網濾過后再次收集離心。離心后組織與10m l培養液(10%FBS的DMEM/F12，抗生素同前)混勻后放入25cm2細胞培養Flask (collagen coated)過夜培養。第2天將上清懸浮細胞液吸除，保留貼壁活性細胞。用EGTA/Trypsin液將貼壁細胞游離收集后過120目篩網。細胞經計數后備用。

3.流式細胞計數:應用直接免疫熒光法檢測細胞表面抗原。所用單克隆干、祖細胞單抗為CD133－PE。管中加入細胞1×106個/毫升，加入20μl CD133－PE熒光抗體。避光孵育20min后，加PBS混懸。采用FACScalibur(BD公司，美國)流式細胞儀，應用CELL－Quest軟件，每管獲取并分析105個細胞。

4.Western blotting:新鮮組織放入液態氮，研磨6～8次，直至細胞與生物重組基膜混合物粉碎融合。細胞裂解液包含Tris液(pH值7.4)、氯化鈉液、1%的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(roche applied science，德國)的NP－40的緩沖液。全細胞裂解液蛋白濃度測定使用BCA試劑盒(Pierce)。蛋白質通過SDS－PAGE電泳轉移到聚偏氟乙烯膜(Millipore)。使用以下抗體:caspase－3、e－cadherin和 GAPDH(Sigma－Aldrich，美國)。蛋白斑點隨后與山葵過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(KPL，美國)或抗兔抗山羊抗體(Santa Cruz)培養。蛋白質的ECL檢測試劑盒的(Pierces)。

5.免疫組化:將10%甲醛固定包埋的結直腸癌標本行4μm厚度連續切片，免疫組織化學方法采用非生物素二步法，常規免疫組織化學染色程序染色;其基本流程為:烤片－脫蠟和水化－抗原修復－免疫組織化學染色－復染、分化－封片－鏡檢、拍照。實驗結果評估標準:用PBS代替一抗作陰性對照。由兩位病理醫師分別雙盲閱片。結直腸癌組織中P53和Ki－67陽性細胞數目判斷方法如下:每張玻片均選擇10個高倍視野;結果取10個視野的平均數。P53按照0～3評分，Ki－67按占總細胞百分比量化比較。

6.實驗設計:按照流式細胞定量評估結果，將CD133+腫瘤干細胞＜3%的病例分于A組，CD133+腫瘤干細胞≥3%的病例分于B組。實驗檢測結果分別在A、B兩組之間比較。

7.統計學方法:運用不成對t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

結果

1.建立了具有可行性的原代結直腸癌單細胞提取體系:原代結直腸癌單細胞的提取需經過取材(圖 1A)、消化過夜培養來確定貼壁的活性細胞(圖1B)、特異性染色(圖1C)和EGTA/Trypsin處理計數(圖1D)等幾個步驟。方法保證了所提取的腫瘤細胞接近100%，并且具有活性。雖然取材后的新鮮癌組織可在4℃保存液中保存1～3天，當天取材后立即提取可得到最佳結果。一般手術取材多在中午或下午進行，然后經過2h左右操作可培養過夜。第二天操作時間約45min可得到備用細胞。提取過程一人操作，簡明可行。

2.準確定量評估癌組織中CD133+腫瘤干細胞:因為CD133是造血干細胞表面標志蛋白，研究首先將外周血單個核細胞作為參照對象和流式細胞儀單色設定參考(圖2A和B)。病例根據CD133檢測結果被分為A組(CD133+細胞＜3%)和B組(CD133+細胞≥3%)。A組CD133+細胞平均為1.7%，B組CD133+細胞平均為7.7%;A組平均腫瘤大小為27cm3，B組為32cm3;A組腸系膜淋巴轉移平均為0.7個，B組為2.4個;A組腫瘤中P53平均表達為1.8分，B組為1.6分(表1)。

圖3 用免疫染色方法比較了兩組病例K i－67的表達

3.CD133的表達與腫瘤增殖和轉移相關:Ki－67是一種增殖抗原，主要定位于細胞核，與細胞周期密切相連，在有絲分裂中起著維持DNA有規則結構的重要作用。腫瘤的增殖速度與預后密切相關。本研究中B組的Ki－67平均表達為74%，比A組的平均表達52%顯著增高(圖3)，說明CD133+細胞增多的癌組織中腫瘤活性也增加了。e－cadherin在多數上皮細胞中有表達。作為一種與抑制腫瘤侵犯和轉移相關的蛋白，e－cadherin在多數癌組織中表達下降。本研究中A組e－cadherin表達較B組增高，細胞凋亡相關蛋白caspase－3的表達在A組中增高(圖4)，這些說明CD133+細胞增多的癌組織中抑制癌轉移的蛋白表達下降，細胞凋亡相關蛋白也下降了。本研究還檢測了正常結直腸黏膜中CD133+細胞的比例。原代正常黏膜上皮細胞CD133+細胞為0.82% ± 0.64%(n=8)，比癌細胞低(3.06%±2.65%，n= 22，P＜0.05)。

圖4 用W estern blotting方法比較了兩組e－cadherin和caspase－3在癌組織和正常黏膜的表達

討論

CD133作為腫瘤中干細胞最重要的標志物已經多次被證實是結直腸癌的一個預后指標，CD133表達率越高預示著患者的預后越差［1～5］。作為一種準確而重要的評估方法，本研究首次提出直接從腫瘤中提取新鮮組織分離細胞，然后用流式細胞計數檢測得到CD133+細胞在腫瘤中的精確比例。這種方法與常規CD133免疫組化得到的結論會有很大的差別［2，3，6］。免疫組化染色的優點是可以明確CD133+細胞在腫瘤中的定位。有報道顯示CD133+腫瘤細胞并沒有均勻分散在癌巢中，而是形成所謂的“熱點”，即CD133+腫瘤細胞通常聚集在一個癌巢或相鄰的幾個癌巢［4］。而同一張切片另外一些癌巢CD133+腫瘤細胞只有少數幾個或是根本沒有。因此，CD133+腫瘤細胞所占的比例很難通過若干張切片而準確得出。本研究的方法是直接從腫瘤組織中提取原代新鮮細胞，這樣即可以保證所檢測的細胞100%為腫瘤細胞，又可以避免因為CD133+腫瘤細胞分布差異而造成的評估誤差。

值得注意的是，CD133+腫瘤細胞≥3%的B組在腫瘤大小和淋巴結轉移個數上都比CD133+腫瘤細胞＜3%的A組高。雖然研究的病例有限(23例)，但是表明了CD133+腫瘤細胞與不良預后相關的趨勢。尤其是在 Ki－67腫瘤增殖標志物的比較中顯示CD133+細胞≥3%的結直腸癌增殖顯著性增高(圖3)。研究顯示在胃腺癌中，CD133+細胞的表達與Ki－67的表達正相關，并且預示著胃癌的最差預后［7］。CD133的表達還與腫瘤的大小和侵犯深度有關，這些都與本研究結果相符。CD133的表達與較短的生存期相關，這提示了CD133+腫瘤細胞相關數據對患者的預后意義重大［3］?；诎└杉毎僭O，癌干細胞在常規治療后可能會通過自身更新和分化導致腫瘤的復發和轉移［8，9］。

雖然結直腸癌組織中CD133+細胞是否全部為腫瘤干細胞仍需要更深入的研究［10］，但是有證據顯示結腸癌組織CD133+細胞移植于裸鼠后具有更高的成瘤率［11］。Todaro等［12］將新鮮分離出的結直腸癌細胞注入裸鼠的皮下，發現其均可形成皮下腫瘤。然而通過免疫磁珠的方法將相同細胞中的CD133+細胞徹底去除后，則發現腫瘤的形成明顯減少。將少量的純化結直腸癌CD133+細胞注入裸鼠中即可形成皮下腫瘤。這些研究表明CD133+細胞是結直腸癌組織中具有腫瘤干細胞特性的亞群，對結直腸癌的形成、生長和轉移起決定性作用。因此，檢測CD133+細胞的量化比例是目前評估結直腸癌干細胞的有效方法之一。

本研究還揭示了結直腸癌中CD133的表達與抑制腫瘤侵犯相關蛋白e－cadherin的關系。在本研究CD133表達量高的結直腸癌中e－cadherin表達有下降的趨勢，說明CD133在結直腸癌中的表達可能與腫瘤的侵犯和轉移相關。另外，本研究顯示CD133表達量高的結直腸癌中caspase－3的表達下降，說明了腫瘤細胞凋亡的減少，這與之前Ki－67增殖相關蛋白在結直腸癌中的表達規律相符?？傊?，CD133+結直腸癌干細胞的存在比例很可能預示著腫瘤的活性與侵犯和轉移能力，這進一步說明了準確定量評估CD133+結直腸癌干細胞的重要性。

綜上所述，本研究成功建立了一套具有可行性的原代結直腸癌干細胞準確定量評估系統。結直腸癌干細胞的準確定量檢測可以作為評估患者預后和化療敏感度的一項重要指標。本技術也為腫瘤細胞化療藥物敏感試驗，進一步提純結直腸癌干細胞，和最終研究對癌干細胞靶點的攻擊提供了平臺。

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