rhBMP－2對兔下頜骨放療后骨延長的影響

麻益可 沈國芳 王麗珍

自Urist首先發現了BMP，以后的研究發現BMP具有促進成骨作用。在BMP家族中，BMP－2、BMP－4、BMP－7的成骨能力最強。rhBMP－2已經被證實在骨愈合中有促進成骨作用［1，2］。Wurzler等［3］發現rhBMP－2可以促進大鼠放射后顱骨缺損的修復，盡管修復的骨量仍然低于為放射組。目前，尚無rh-BMP－2作用于放射后頜骨骨延長的研究和報道。通過先期的研究表明，放射后兔下頜骨骨延長的新生骨形成受到了抑制。本研究的目的就在于在截骨間隙置入rhBMP－2以觀察其能否促進新生骨的形成。

材料與方法

1.材料:本研究置入材料核心成分是rhBMP－2，載體材料是藥用明膠、大豆卵磷脂及羥基磷灰石，由杭州華東基因技術研究所贊助提供。牽引器由浙江慈北醫療器械公司提供，依據兔下頜骨定制的手控式內置式牽引器，由牽引桿、牽引體和固定腳組成，牽引螺距為0.40mm/360°，最長牽引長度為15.0mm。

2.實驗動物入選標準及分組:雄性新西蘭大白兔，約6月齡，體重2.0～3.0kg，共12只兔。兔入圈圈養1周，隨機化實驗分為兩組，每組各6只，具體如下:①對照組:術前接受50Gy放射劑量，間歇1個月后進行骨延長;②rhBMP－2組:與對照的差別僅在術中置入骨優導，其他均一致。

3.放射處理:由上海交通大學附屬第九人民醫院口腔頜面外科放療室提供專業放射人員和Theration 780－C型60Co遠距離治療機(AECLmedical，加拿大)，照射方式是外照射。隨機確定實驗放射側，放射在全麻下進行。以第1前磨牙前緣中點為放射中心，照射野大小為3.0cm×3.0cm，源皮距為80cm，表面覆蓋一層等效物。放射方案為:每次5.6Gy，每天照射1次，連續照射5天(根據TDF表，上述放射方案相當于常規放射的25次50Gy)。

4.手術:術前無需禁食，肌內注射速眠新Ⅱ液0.1ml/kg和氯氨酮0.1ml/kg，麻醉起效后，雙側頜下、面部和頸部備皮，剪除兔毛。側臥于手術臺，四肢固定，常規消毒鋪巾。手術部位加以0.5%利多卡因皮下局部注射，以加強麻醉效果。對照組:切口于放射側下頜下，切開皮膚及皮下組織，長約2.0cm，尋及面動靜脈予以結扎、剪斷，以減少出血。暴露下頜骨頰側，橫行切開骨膜并剝離骨膜，顯露下頜骨骨質、頦孔和下牙槽神經，剪斷下牙槽神經，推開。剝離時保護頰側牙齦附著，避免與口腔相通。舌側骨膜不予剝離，以盡量保留下頜骨血供。截骨于第1前磨牙前和頦孔間。于下頜角切開長約3mm皮膚切口，牽引桿穿過皮下層和該切口，放置于其后方，預安置牽引器，各骨段2枚自鉆螺釘固定，拆除牽引器。以φ1mm小球鉆以2000r/min的速度逐層去除頰側骨皮質、骨松質，同時予無菌生理鹽水沖洗、冷卻;舌側骨皮質以骨鑿輕輕鑿斷。伸入骨鑿于截骨線，以能完全撬動兩側骨段為截斷標準，原位復置牽引器。創口沖洗，充分止血，常規縫合關創。于對側相同位置以相同方法截斷下頜骨，不安置牽引器，逐層關創。術中根據需要，可適時追加麻醉藥物初次劑量的半量。rhBMP－2組與對照組的差別在于:試牽引成功后，復位;創口沖洗，充分止血后將rhBMP－2填入截骨間隙。待兔完全蘇醒，送回籠中，與精飼料為主，卷心菜為輔喂養。術后當天開始肌內注射30000U青霉素，每天2次，連續注射7天。

5.牽引方案:間歇8天后開始牽引，每天0.4mm，每天2次，連續牽引10天，固定期6周。

6.觀察和評價指標:(1)活體觀察:術后觀察兔的進食、創口愈合等情況。固定期6周結束時，處死后取得兩側下頜骨離體標本。觀察新生骨的外形和質地，測量新生骨的長度。(2)X線片評價:分別于牽引結束次日、固定期3周和固定期6周時在拍攝下頜骨橫斷咬合X線片以觀察牽引間隙是否有效形成、牽引間隙內骨質狀況等。(3)HE組織學:離體標本拍好X線后立即鋸取新生骨，以10%中性緩沖甲醛液固定，由上海交通大學附屬第九人民醫院口腔頜面外科病理室完成脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片和HE染色等，切片切面為下頜骨橫斷面。

隨機取每個標本最中央且放大倍數為4×10的圖片4張，應用Image－Pro Plus 4.5.1圖像分析軟件進行組織學半定量分析，分別測量新生骨骨小梁總面積和視野總面積，并計算骨小梁面積比，記平均值。計算公式:骨小梁面積比=骨小梁面積總面積/視野總面積。數據用統計軟件分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.活體觀察:所有動物都完成了實驗，有效形成牽引間隙并存活到固定期6周。牽引完成后，下頜明顯偏向對側，上下前牙均處于空咬狀態。上下前牙隨時間推移而伸長，并造成下頜口腔黏膜的創傷性潰瘍，但均不影響進食。

2.大體標本觀察:實驗組和對照組的螺釘均與骨組織固定牢固。實驗側下頜骨新生骨均呈直線延長，延長長度6.7±1.1mm。所有舌側、上下端及頰側骨皮質與周圍骨質無明顯的界限，連續性完好，難以區分原有骨質與新生骨的界限。頰舌側骨質均致密，質硬(圖1)。兩組在大體標本上無明顯差別。對側的截骨部位也可見臨床正常愈合，未見骨段間的錯位愈合，難以分辨出截骨線。

3.X線檢查:牽引結束次日，均可見牽引間隙有效形成;牽引間隙內為低密度軟組織透光區，截骨邊緣銳利清晰，無骨質形成跡象。骨優導透射X線，未能顯影。固定期3周時，均可見整個牽引間隙內較均勻、密度略低于正常的阻射影，呈細條帶排列，方向與牽引力方向一致，截骨邊緣模糊不清，骨皮質影隱約可見，但是未見典型的骨小梁結構和中央區。rhBMP－2組牽引間隙內，可以區分出骨皮質。50Gy組未見明顯的骨皮質高密度影。固定期6周時，牽引間隙內充滿高密度影，密度與周圍骨質相似，原截骨邊緣消失;可見骨小梁，均勻分布于新生骨內，排列方向與牽引方向一致。頰舌側骨皮質致密。分辨不出兩組間的差別(圖2)。

4.組織學觀察:HE染色兩組均可見形成新生骨組織，密質骨和松質骨均可見帶狀淺藍色類骨質，骨小梁排列方向均與牽引方向相同。兩組的骨小梁均較稀疏、細小，分布較均勻;密質骨和骨小梁內含有豐富的骨細胞，骨細胞核呈圓形，骨陷窩周圍被環形類骨質包繞;大部分骨小梁邊緣可見大量為柱狀或立方

圖2 X線圖

狀成行緊密排列的成骨細胞，排列整齊;未見哈佛氏系統和破骨細胞，骨髓均為脂肪性骨髓。兩組中均未見軟骨形成。所有12個標本的骨小梁間都可以見到成片狀致密纖維結締組織(圖3)。

圖3 HE染色組織學表現

5.統計學結果:rhBMP－2組和50Gy組骨小梁面積比分別為0.459±0.036，0.445±0.054。經過統計學分析，P=0.61(＞0.05)，兩組之間差異無統計學意義。

討論

BMP是一種疏水酸性糖蛋白，現已發現BMP－1～13，其中起重要作用是BMP－2、BMP－4、BMP－7。BMP能促進細胞的有絲分裂和轉化，能誘導未分化的間充質細胞分化為成骨細胞和成軟骨細胞，從而促進成骨［4～6］。研究還表明rhBMP－2具有強大的促進成骨作用，而且rhBMP－2誘導形成的新骨，經組織學、生物力學和放射影像學證實，與正常骨質無差別［7，8］。Wurzler等［3］研究發現rhBMP－2可以促進大鼠放射后顱骨缺損的修復，但是形成的新骨仍不如未放射者。在本研究中rhBMP－2組和50Gy組的新生骨頰舌側骨皮質均致密、質硬。在牽引結束后、固定期3周、6周的X線片，都顯示相似的成骨表現。組織學可見兩組的骨小梁密度均較稀疏、細小，骨小梁間存在致密纖維結締組織。這些均提示，rhBMP－2未能促進兔下頜骨放射后骨延長的新生骨形成。

研究表明，新生骨的形成量和骨密度與局部置入的rhBMP－2初始濃度和持續時間正相關。rhBMP－2單獨局部使用效果并不理想，主要原因是rhBMP－2作為多肽生長因子在局部很容易被稀釋、分解和吸收，不能長久有效的刺激靶細胞。因此，具有緩釋性能的rhBMP－2產品更有利于成骨［9］。本研究術中同期置入的核心和主要成分是二聚體rhBMP－2，純度在95%以上，且其中含有具有緩釋性能的少量卵磷脂作為載體，在2～3周內緩慢完全釋放。

眾多研究表明rhBMP－2也可以在骨延長中可以促進成骨。諸多等研究表明rhBMP－2對骨延長有明顯的促進新生骨形成作用［10，11］。研究發現，rh-BMP－2最佳局部濃度與動物種屬級別正相關;犬類下頜骨最佳濃度約為人類下頜骨1/2。由此可以推斷，兔下頜骨的用量應該更少。根據本研究者測得，人體下頜骨體部的冠狀截面積約為2.7cm×1.2cm;兔本實驗的截骨部位處截面積約為1.0cm×0.6cm，為前者的1/5.4。以此可以推斷，兔局部下頜骨截骨處的rhBMP－2用量應該少于人的1/10。本研究中骨延長的截骨間隙僅約2mm，而且兔下頜骨體部短小，僅能容納約2.0mg的rhBMP－2復合材料。該劑量約為廠商人體推薦用量的1/10，而且也有研究證實1.5mg的rhBMP－2完全能促進新骨形成［11］。因此，術中同期置入量是合理的。

Wurzler等［3］研究還發現在促進大鼠放射后顱骨缺損的修復時，rhBMP－2劑量高效果較劑量低者好。在本部分研究中，兩組的新生骨沒有明顯的差別。是2.0mg rhBMP－2不足以促進成骨?或者是rhBMP－2本身對放射后骨延長新生骨的形成沒有促進作用?這尚需要進一步的研究。

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