晚期糖基化終產物引起內皮細胞connexin43表達上調

章順榮 高 越 封 菲 洪鳴鳴

糖尿病常引起大小血管病變，大血管病變中最常見的是動脈粥樣硬化，糖尿病是冠心病的等危癥，然而糖尿病易患動脈粥樣硬化的機制仍未完全明了。糖尿病血管并發癥的發病機制中晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)起著重要作用，AGEs可以通過多種機制促進動脈粥樣硬化的發生發展［1］。AGEs能引起內皮細胞結構和功能異常，而后者在動脈粥樣硬化的發病機制中起著關鍵作用。組成縫隙連接的蛋白亞單位稱為connexins，現已發現20種以上的connexins亞型，內皮細胞表面有connexin37、40和43的表達［2］。connexins在維持內皮整體功能協調中起著重要作用，研究表明connexin43的改變與內皮功能異常及動脈粥樣硬化的發生發展相關［3］。AGEs是否可以通過影響內皮細胞connexin43表達而促進動脈粥樣硬化的發生發展尚不明確。本研究對AGEs是否可影響體外培養的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelium cells，HUVECs)connexin43的表達做一探索。

材料與方法

1.材料:牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，D－葡萄糖，1640細胞培養液，胰酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)和胎牛血清購自上海澤衡生物科技公司，內皮細胞株購自南京凱基生物科技公司，Trizol和 RT－PCR試劑盒購自Invitrogen公司，connexin43和GAPDH引物對由上海澤衡生物科技公司合成，兔抗人connexin43多克隆抗體購于Abcam公司(Catalog Number ab62689)，熒光標記的羊抗兔IgG抗體，山羊血清，C液購自北京中杉金橋生物科技有限公司，Triton X－100購自上海生工生物工程有限公司，DAB顯色液購自福州邁新生物技術開發有限公司。

2.AGEs的制備:0.5mol/L的D－葡萄糖和50mg/m l牛血清白蛋白溶解在0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液中，用0.2μm的濾器過濾除菌后置于37℃恒溫箱內避光孵育。90天后取出，AGE－BSA呈深黃色，裝入低分子量透析袋，以PBS液充分透析72h，中途更換透析液1～2次以除去未結合的低分子物質。透析后用0.2μm的濾器過濾除菌后－80℃保存。用熒光分光光度計檢測AGE－BSA最大發射波長為460nm，最大激發波長為360nm，檢測AGE－BSA的蛋白濃度為50mg/m l。

3.內皮細胞培養及AGEs的干預:人臍靜脈內皮細胞株接種于6孔板培養基，常規傳代，待內皮細胞生長至約80%滿后換液，對照組繼續以含10%胎牛血清的1640培養液培養，而另外3組則在10%胎牛血清的1640培養液中分別加入不同濃度的AGEs，使AGEs的終濃度分別為100mg/L，200mg/ L，400mg/L。繼續培養24h后，去除培養液，PBS液沖洗后，加入Trizol 2ml，提取各組的總RNA，－20℃條件下保存。另兩組內皮細胞按2×104/ml濃度接種于含有載玻片的6孔板培養基，分為對照組和200mg/L AGEs干預組，待內皮細胞生長至鋪滿80%玻片后換液，對照組繼續以含10%胎牛血清的1640培養液培養，干預組則在培養液中加入終濃度為200mg/ L的AGEs，繼續培養24h后去除培養液，PBS液沖洗后進行免疫熒光染色。

4.connexin43基因mRNA表達水平的檢測:提取的各組RNA通過紫外分光光度計測定260和280nm處吸光度值，計算RNA純度和濃度。按反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，再進行PCR擴增。Premier5.0軟件設計PCR引物對，connexin43基因的PCR引物序列為5'－GAGCGGATAC AGAGGAG GA－3'(上游)，5'－CTCCACCCATCTACCCCATAC－3'(下游)。內參GAPDH的引物序列為:5'－CGTGAAAGATGTCGTGGAA－3'(上游)，5'－TGGAAGATGGTGA TG GGAT－3'(下游)。connexin43基因PCR擴增條件為: 95℃ 5min 1循環，之后95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，共35個循環，最后72℃ 10min 1循環，產物長度為383次/分;內參GAPDH基因PCR擴增條件為:95℃5min 1循環，之后95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共32個循環，最后72℃10min 1循環，產物長度為223bp。PCR反應體系為20μl體系。PCR反應產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳判斷結果，Bio RAD成像系統拍攝照片用于分析。

5.connexin43蛋白表達水平的檢測:主要步驟如下:①PBS清洗標本3次各1min;②4%的多聚甲醛固定20min;③空氣干燥5min;④PBS清洗標本3次各2min;⑤0.5%Triton X－100孵育1次20min;⑥PBS清洗標本3次各2min;⑦3% H2O2孵育15min，DPBS清洗標本3次各2min;⑧標本予以兔抗人connexin43多克隆抗體(效價1∶200)4℃孵育過夜;⑨PBS液沖洗4次，各5min，加入熒光標記的二抗，室溫孵育30min;⑩PBS液沖洗4次后90%甘油封片。最后在熒光顯微鏡下觀察結果，拍攝照片用于分析。

6.統計學方法:運用ImageJ 1.43圖像分析軟件對mRNA電泳圖片和免疫細胞熒光染色圖片進行灰度掃描半定量分析。運用SPSS 13.0統計軟件包進行數據統計分析。mRNA電泳圖片采用各組connexin43條帶與其GAPDH條帶的灰度比值作為統計變量，采用t檢驗分析;免疫細胞熒光染色圖片以細胞灰度值作為統計變量，采用t檢驗分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

結果

1.AGEs對內皮細胞connexin43基因mRNA表達的影響:不同濃度(100、200、400mg/L)的AGEs干預24h后引起內皮細胞connexin43 mRNA的表達水平上調(表1和圖1)。

表1 不同濃度AGEs對HUVECs connexin43 m RNA表達的影響(n=6±s)

表1 不同濃度AGEs對HUVECs connexin43 m RNA表達的影響(n=6±s)

*與對照組相比，P＜0.01

0.38±0.024 100mg/L AGEs干預組 0.94±0.037* 200mg/L AGEs干預組 1.01±0.034* 400mg/L AGEs干預組 0.92±0.065組別 灰度比值對照組*

圖1 不同濃度(100、200、400mg/L)的AGEs刺激后內皮細胞connexin43 m RNA表達水平

2.AGEs對內皮細胞connexin43基因蛋白表達的影響:見圖2。對照組及200mg/L的AGEs干預組24h后 connexin43灰度值分別為 64.28±4.34、97.41±6.80。免疫熒光方法檢測發現內皮細胞connexin43的蛋白表達水平上調(P＜0.01)。

圖2 免疫熒光染色結果

討論

糖尿病常引起全身大血管和小血管病變，研究表明合并糖尿病的冠心病患者冠狀動脈粥樣硬化病變更嚴重、更彌漫，AGEs在糖尿病血管病變的發生發展中起著關鍵的作用［4］。AGEs的形成先由還原葡萄糖的醛基或酮基與生物分子如蛋白質或脂質的游離氨基反應形成早期可逆產物堿，再經分子內重排形成更穩定的產物進一步脫水和凝聚形成不可逆的終末產物，呈棕黃色，可發熒光，糖尿病及慢性腎功能不全患者，體內AGEs的積聚明顯增加［5］。AGEs能通過多種途徑促進動脈粥樣硬化的發生發展。AGEs刺激血管內皮細胞能增加誘導型一氧化氮合酶mRNA表達，誘導內皮細胞表達內皮素－1、血管細胞黏附分子－1、細胞間黏附分子－1、E－選擇素、組織因子、血栓素、白細胞介素IL－1、IL－6、腫瘤壞死因子，以及AGEs受體(RAGE)等，促使內皮細胞凋亡，引起單核－吞噬細胞遷移，吞噬脂質，啟動動脈粥樣硬化的病理過程，促進早期動脈粥樣硬化斑塊的形成［6］。研究表明，抑制糖尿病患者體內AGEs的形成能有效延緩動脈粥樣硬化的進展［7］。

近年來connexin43在動脈粥樣硬化發病機制中的作用日益引起人們的重視［8］。人類冠狀動脈粥樣硬化的早期，其增厚的內膜中縫隙連接蛋白connexin43表達明顯增強［9］。Kwak等［10］研究表明通過connexin43基因半敲除的LDL受體基因缺陷的小鼠(LDLR－/－Cx43+/－)與LDL受體基因缺陷的帶有正常connexin43基因的小鼠(LDLR－/－Cx43+/ +)相比，其connexin43蛋白表達減少，喂養高膽固醇飼料14周后其胸腹主動脈和主動根部動脈粥樣病變比LDLR－/－Cx43+/+減少50%(P＜0.01)，且LDLR－/－Cx43+/－小鼠粥樣硬化斑塊中含更少的炎癥細胞，有更厚的纖維帽，含更多的膠原和平滑肌細胞。他汀類調脂藥能減少血管內皮細胞connexin43的表達，而他汀類藥物的抗動脈粥樣硬化作用可能也與此有關［11］。Dai等［12］模擬斑塊易感和抵抗區域的動脈波型，應用于培養的內皮細胞，對其表型進行了觀察，結果發現斑塊易感波形引起connexin43表達上調。Chadjichristos等研究發現connexin43基因半敲除的LDL受體基因缺陷的小鼠(LDLR－/－Cx43+/－)球囊損傷頸動脈內膜后其新生內膜的厚度比LDLR－/－Cx43+/+的小鼠減小，巨噬細胞浸潤也更少?？傊壳暗难芯刻崾緝绕onnexin43可能具有促動脈粥樣硬化作用，減少connexin43的表達能相應的減輕動脈粥樣硬化病變的程度。而作為糖尿病血管病變關鍵因素的AGEs能否影響內皮細胞connexin43的表達尚不清楚，這是一個值得研究的靶點。

本研究用AGEs干預體外培養的人臍靜脈內皮細胞，以觀察AGEs能否影響人臍靜脈內皮細胞connexin43的表達。結果發現不同濃度(100、200、400mg/L)的AGEs均能引起人臍靜脈內皮細胞connxin43基因mRNA的表達增加;200mg/L的AGEs干預人臍靜脈內皮細胞24h后可引起connexin43蛋白的表達水平增加。這些結果提示AGEs干預內皮細胞后在轉錄水平引起縫隙連接蛋白connexin43基因的表達上調。由于內皮connexin43可能有促動脈粥樣硬化作用，AGEs可通過上調血管內皮細胞connexin43的表達而促進動脈粥樣硬化的發生發展。

AGEs引起內皮細胞connexin43基因表達上調的機制尚有待于進一步研究明確。目前研究表明人類connexin43基因的轉錄調控，涉及轉錄因子Sp1、Sp3、AP1、Nkx2.5、Tbx2等，此外，幾條信號通路也參與了connexin43的轉錄調控。AGEs與其受體RAGE結合可激活內皮細胞多種信號轉導通路，引起多種核轉錄因子的激活和轉位，啟動多種靶基因的轉錄，其中也可能包括connexin43基因，進而引起內皮細胞connexin43的表達上調，當然尚有待于進一步研究證實。

總之，本實驗研究初步提示，AGEs短期干預能引起體外培養的人臍靜脈內皮細胞縫隙連接蛋白connexin43基因mRNA和蛋白的表達水平增加，提示內皮connexin43在AGEs促動脈粥樣硬化的發病機制中起著重要的作用。本研究對糖尿病患者動脈粥樣硬化發病機制的進一步探索具有一定的意義，對動脈粥樣硬化的防治也有一定啟示作用。

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3 章順榮，洪鳴鳴.縫隙連接蛋白與動脈粥樣硬化［J］.中國動脈硬化雜志，2008，16(8):662－664

4 Yamagishi S.Role of advanced glycation end products(AGEs)and receptor for AGEs(RAGE)in vascular damage in diabetes［J］.Exp Gerontol，2011，46(4):217－224

5 Zong H，Ward M，Stitt AW.AGEs，RAGE，and diabetic retinopathy［J］.Curr Diab Rep，2011，11(4):244－252

6 Jandeleit－Dahm K，Watson A，Soro－Paavonen A.The AGE/ RAGE axis in diabetes－accelerated atherosclerosis［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35(3):329－334

7 Josephine F，Louis TL，Vicki T，et al.Advanced glycation end product interventions reduce diabetes－accelerated atherosclerosis［J］.Diabetes，2004，53(7):1813－1823

8 Morel S，Burnier L，Kwak BR.Connexins participate in the initiation and progression of atherosclerosis［J］.Semin Immunopathol，2009，31(1):49－61

9 Chadjichristos CE，Morel S，Derouette JP，et al.Targeting connexin 43 prevents platelet－derived growth factor－BB－induced phenotypic change in porcine coronary artery smooth muscle cells［J］.Circ Res，2008，102(6):653－660

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