地西他濱聯合丙戊酸鈉體外誘導1例AM L－M 2復發患者原始細胞凋亡分化的作用研究

陳瓊娜 王曄愷 周吉航 李翊衛 曾 芳 劉曉光

地西他濱(decitabine，DCA)主要成分為5－雜氮－2'－脫氧胞苷，為一種去甲基化藥物，目前獲批用于中高危骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)的治療。在先前的研究中，我們發現體外AML細胞株中利用DCA可引起其生長抑制、促其凋亡和分化［1］。在國外臨床試驗中，DCA聯合某些組蛋白去乙酰化酶抑制劑藥物如丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)對難治/復發性AML患者往往能收到較好的療效［2］。由于國內 DCA尚未正式獲批用于AML的治療，因此我們通過分選一例難治/復發性的AML－M2患者的原始細胞，體外觀察兩藥物對其促凋亡和分化的影響，為兩藥聯合治療AML提供更多的實驗依據。

材料與方法

1.儀器和試劑:地西他濱(5－氮雜－2'－脫氧胞嘧啶核苷粉劑)購自Sigma，丙戊酸鈉粉劑(德巴金針)購自賽諾菲－安萬特，AnnexinⅤ/PI凋亡試劑盒、CD14－FITC、CD117－PE均購自美國BD公司，流式細胞儀為美國BD FACSCalibur帶分選模塊。

2.病例簡介:患者，女性，2010年5月初發AML－M2a，47歲，經阿糖胞苷聯合柔紅霉素聯合化療后獲得初步緩解，10個月后復發。復發時仍為M2a，外周血WBC 1.7×109/L，RBC 2.74×109/L，Hb 101g/L，PLT 123×109/L。原始細胞群主要流式髓系免疫表型:CD117:76.33%，CD14:11.13%，CD11b: 18.12%，CD13:37.32%，CD33:3.62%。

3.流式分選:使用患者復發時的骨髓2ml，溶血后以CD45－SSC設門(圖1)，選取中等CD45表達和低SSC的原始細胞群(圖1)，分選至50ml分選管，分選多管(分選模式為得率優先)，高速離心富集。

圖1 AM l－M 2a原始細胞分選

4.細胞培養及藥物處理:將富集后的細胞采用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液在37℃、5%CO2的培養箱中培養，同時加入藥物(藥物設立分組見表1)，配制濃度為1×105個/毫升的細胞懸液接種于6孔培養板，2毫升/孔，置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，，作用48h后各孔吸出培養液，分為3份進行以下各步實驗，每份設置6個藥物濃度組，每組設3復孔。

表1 藥物濃度組設立(其中藥物濃度均為終濃度)

5.AnnexinⅤ/PI標記法觀察凋亡:取“細胞培養及藥物處理”步驟中第1份細胞，用預冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。每管加10μl Annexin V和5μl PI，避光靜置15min，加200μl預冷的PBS，振蕩混勻，上機檢測其早期凋亡率。

6.CD117、CD14檢測:細胞培養及藥物處理步驟第2、3份細胞用預冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。第2份加CD117 10μl，第3份加CD14各10μl，避光靜置15min上機，計算CD117和CD14表達率。

7.統計學方法:采用SPSS 13.0軟件，對各組中早期凋亡率、CD117和CD14表達率做單因素方差分析和LSD兩兩檢驗，以P＜0.05為具有顯著統計學意義。

結果

1.AnnexinⅤ/PI標記法檢測凋亡:見圖2，空白對照組、DCA單藥A組、DCA單藥B組、VPA單藥組、聯合用藥A組、聯合用藥B組的早期凋亡率分別為12.12%±0.84%、15.32%±0.75%、24.11%± 2.10%、14.11% ±2.13%、38.14% ±2.10%、44.11%±2.12%，聯合用藥A組高于DCA單藥A組和VPA單藥組，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)，聯合用藥B組高于DCA單藥B組和VPA單藥組，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)。

圖2 各藥物濃度組早期凋亡率(Annexin V+/PI－)

2.CD117、CD14分化抗原檢測:見圖3、圖4，空白對照組、DCA單藥A組、DCA單藥B組、VPA單藥組、聯合用藥A組、聯合用藥B組的CD117表達率分別為70.22%±1.92%、66.90%±1.23%、60.32%± 2.10%、65.17% ±1.09%、51.19% ±1.46%、40.30%±2.18%，聯合用藥A組低于于DCA單藥A組和VPA單藥組，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)，聯合用藥B組低于DCA單藥B組和VPA單藥組，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)。DCA單藥A組、DCA單藥B組、VPA單藥組、聯合用藥A組、聯合用藥 B組的 CD14表達率分別為7.32% ± 0.32%、9.11%±0.47%、13.45%±1.02%、12.22%± 0.91%、17.13%±1.45%、19.11%±1.69%，聯合用藥A組高于DCA單藥A組和VPA單藥組，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)，聯合用藥B組高于DCA單藥B組和VPA單藥組，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)。

討論

DCA作為一種甲基轉移酶抑制劑，主要通過抑制DNA甲基轉移酶，逆轉DNA的甲基化過程，激活多種抑癌基因表達，誘導腫瘤細胞凋亡或向正常細胞分化［3］。DCA單用治療骨髓異常增生綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)效果已超越傳統治療手段［4～6］。MDS一般在數月至數年內轉化為AML，且部分類別的核型異常的MDS進展為AML的可能性更大，DCA在MDS治療中的積極成果給治療AML的探索奠定了基礎［7］。DCA對于部分不能接受標準化療方案(Ara－C+DNR)的老年AML患者、部分MDS轉化而來的AML以及部分難治/復發AML患者效果較好，充分顯示了其治療AML的巨大潛力［8，9］。但從目前國外總體的臨床情況來看，DCA對于AML治療效果不如MDS穩定，存在較大的個體差異。國外研究表明DCA和VPA聯用在體外多種腫瘤細胞中均體現出較佳的抗腫瘤活性和恢復抑癌基因表達的效果，如盧等［10］聯用DCA和VPA對U266細胞恢復抑癌基因RASSF1A基因的表達，Luszczek等［11］聯用DCA和VPA作用于小細胞肺癌引起其DNA損傷。這都說明表觀遺傳學調控中，組蛋白去乙酰化和DNA甲基化兩種機制可以相互協調，共同調控細胞活性。由于目前國內DCA尚未正式獲批用于AML患者的治療，因此我們通過流式分選出AML患者的骨髓原始細胞體外與藥物作用觀察其對白血病細胞的促凋亡分化作用。本研究顯示DCA和VPA體外顯示出協同促原始細胞凋亡的能力，其中空白對照組的早期凋亡率達到了10%左右，可能和細胞經流式電極分選后的表面輕度損傷有關。

在臨床治療MDS的應用中，DCA主要的不良反應為骨髓抑制導致血三系降低，進而引起感染風險的增加，一般需要口服抗生素加以預防。有報道顯示，DCA能促進MDS－RAEB細胞株SKM－1向成熟髓系細胞分化，增強CD14和CD11b成熟髓系抗原的表達，CD14為脂多糖(LPS)受體，存在于單核細胞、巨噬細胞等細胞表面的白細胞分化抗原，識別、結合LPS，介導LPS性細胞反應，在LPS性炎癥反應、內毒素休克等病理反應中起重要作用［12，13］。本研究顯示DCA和VPA體外聯用能促進CD14的表達，提示其增強了體外抗革蘭陰性菌能力。CD117作為c－kit受體膜外區分子表面抗原標志，表達于造血祖細胞、不成熟粒細胞和肥大細胞，多數AML的原始細胞中均有CD117的表達，并且CD117的高表達和細胞的惡性程度相關，往往預示著預后不良。本研究還顯示VPA協同DCA降低CD117的表達，從分化抗原角度說明它們能共同作用于降低腫瘤細胞的惡性程度。但是體內兩藥聯用是否也存在類似的效應，尚需進一步研究。

1 王曄愷，周吉航，周世權，等.急性髓系白血病患者hPer3基因啟動子甲基化狀態及其去甲基化對白血病細胞增殖的影響［J］.中華血液學雜志，2011，32(5):317－321

2 Blum W，Klisovic RB，Hackanson B，et al.Phase Istudy of decitabine alone or in combination with valproic acid in acute myeloid leukemia［J］.JClin Oncol，2007，25(25):3884－3891

3 Bryan J，Kantarjian H，Garcia－Manero G，et al.Pharmacokinetic evaluation of decitabine for the treatment of leukemia［J］.ExpertOpin Drug Metab Toxicol，2011，7(5):661－672

4 Lubbert M，Suciu S，Baila L，et al.Low－dose decitabine versus best supportive care in elderly patients with intermediate－or high－risk myelodysplastic syndrome(MDS)ineligible for intensive chemotherapy:final results of the randomized phase IIIstudy of the European Organisation for Research and Treatment of Cancer Leukemia Group and the German MDS Study Group［J］.J Clin Oncol，2011，29(15): 1987－1996

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10 盧菲，劉傳方，馬道斯，等.丙戊酸鈉協同5－雜氮－2'－脫氧胞苷對U266細胞RASSF1A基因表達調控的影響［J］.中華血液學雜志，2010，31(4):223－227

11 Luszczek W，Cheriyath V，Mekhail TM，et al.Combinations of DNA methyltransferase and histone deacetylase inhibitors induce DNA damage in small cell lung cancer cells:correlation of resistance with IFN－stimulated gene expression［J］.Mol Cancer Ther，2010，9(8):2309－2321

12 楊力，徐瑞容，黃紅銘，等.地西他濱對MDS細胞株SKM－1的作用研究［J］.交通醫學，2007，21(1):34－35

13 Dessing MC，Knapp S，Florquin S，et al.CD14 facilitates invasive respiratory tract infection by Streptococcus pneumoniae［J］.Am JRespir Crit Care Med，2007，175(6):604－611