肺炎鏈球菌的擴增片段長度多態性快速檢測方法的建立和應用

楊錦紅 劉 洋 王新林 李方去 陶洪群 李向陽

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，S.p)在世界范圍內仍然是一種重要的病原體，可引起肺炎、腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎及菌血癥等多種嚴重疾病［1，2］。對肺炎鏈球菌的診斷，目前主要依賴傳統方法——培養法進行檢測，但是培養法需要對微生物分離、培養和鑒定等檢測存在著耗時長、靈敏度低、操作繁瑣等缺點，對臨床快速診斷，尤其是侵襲性感染的診斷不及時，造成臨床治療上的延誤。隨著分子生物學技術的發展，肺炎鏈球菌的快速診斷研究進展迅速，其中有環介導等溫核酸擴增技術(LAMP)、PCR檢測核糖體(16SrRNA)、BOX－PCR、熒光定量PCR、免疫層析法、DNA探針雜交等，從基因/基因組的層面對肺炎鏈球菌進行快速診斷［3，4］。

材料與方法

1.菌株來源:2010年3～6月在溫州醫學院附屬第二醫院住院患兒送檢的呼吸道、血液及腦脊液標本分離的非重復的20株肺炎鏈球菌。質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619。

2.儀器:Microscan Walkaway－90SI型全自動細菌鑒定儀(德國西門子公司)、PCR儀(德國Eppendorf公司產品)、電泳儀(美國BIO.RAD公司)、凝膠成像系統(北京六一公司)

3.試劑:PCR試劑和DNA MarkerⅠ購于TaKaRa大連寶生物公司，引物參照文獻設計［5］，由上海生工生物技術有限公司合成。限制性內切酶EcoRⅠ、MseⅠ購自Fermentas公司，DNA分子質量對照購自MBI公司。EcoRⅠ接頭、MseⅠ接頭、引物序列見表1。

4.菌種鑒定及藥敏試驗:挑選血平板上臍窩狀的可疑菌落分純，同時做奧普托欣(Optochin)試驗，再用 Microscan Walkaway－90SI型全自動細菌鑒定儀鑒定及藥敏試驗，判斷標準參照CLSI(2010版)標準。

5.AFLP實驗:根據張順等［6］報道的方法改進后用于實驗。(1)基因組DNA的制備:細菌DNA的制備:挑3～5個菌落調制成0.5麥氏點菌液，采取一系列稀釋梯度，配制成濃度依次為1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103、1.5×102、1.5×10、1.5CFU/ml的菌液，收集細菌采用CTAB法提取肺炎鏈球菌染色體DNA即為擴增檢測的模板液，用1%瓊脂糖電泳檢測基因組DNA，并用紫外分光光度計定量。(2)基因組DNA的雙酶切:取基因組DNA各2μl，內切酶EcoRⅠ5U、MseⅠ5U，10×Buffer 4μl，補水至40μl，先在37℃水浴5h，然后轉入65℃水浴2h，用1%瓊脂糖電泳檢測酶切產物。(3)接頭的連接反應:取酶切產物20μl，EcoR I Adapter、Mse I Adapter各1μl，T 4 DNA連接酶0.5μl，10× Buffer 3μl，補水至30μl，22℃，連接過夜。(4)PCR擴增:PCR擴增反應體系體積為25μl，上下游引物(20μmol/L)各0.5μl，dNTP(100mmol/L)2μl，模板 DNA 3μl，MgCl2(25mmol/L) 1.5μl，10×PCR buffer 2.5μl，EX Taq酶(5U/μl)0.125μl，ddH2O 14.375μl，混勻后進行擴增反應。循環參數為:94℃預變性4min，然后94℃15s→65℃30s→72℃15s共40個循環，最后72℃延伸10min。(5)電泳分析:將產物放在6%的瓊脂凝膠中，150V電泳20min后用凝膠成像儀觀察DNA條帶的分布，產物片段多在100～600bp之間呈現出梯狀分布，特征性條帶明顯，具有較強的辨識度。

結果

1.特異度試驗:檢測20株肺炎鏈球菌，結果均陽性(圖1)。15株非肺炎鏈球菌均陰性，金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌、宋內志賀菌、傷寒沙門菌、粘質沙雷菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌及銅綠假單胞菌等多種細菌均為陰性，見圖2。表明AFLP－PCR具有良好的特異性。

圖1 20株肺炎鏈球菌AFLP圖譜1～19.肺炎鏈球菌臨床分離株;20.肺炎鏈球菌ATCC49619，M.Marker

圖2 特異性試驗AFLP結果

2.靈敏度試驗:經活菌平板計數，檢測細菌原液濃度為1.5×108CFU/ml，分別進行稀釋成為1.5× 108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5× 103、1.5×102、1.5×10、1.5CFU/ml，AFLP－PCR方法可檢測到第6個稀釋度，最低檢測濃度為1.5× 103CFU/ml，見圖3。

圖3 敏感性AFLP－PCR結果

討論

傳統細菌培養分離生化鑒定方法作為細菌診斷的金標準，檢測肺炎鏈球菌，從微生物分離培養和形態學鑒定到生化分析，做出確診整個過程約需2～3天;而對于肺炎鏈球菌所致感染，尤其是侵襲性的深部感染，要求快速、方便的特點，該法不能滿足要求。近年來，以PCR技術為代表的病原核酸檢測技術得到不斷發展。其中，PCR、熒光定量PCR作為快速檢測技術得到了一定的應用。然而這些方法雖然可用于快速檢測，但因靈敏度和特異度上的差別，加上檢測費用較高，在現場使用有一定的局限性。擴增片段長度多態性快速檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步，現已建立起來的AFLP－PCR具有高效、快速、簡便的優越性，為及時快速檢測提供了新方法。

本研究中選擇了肺炎鏈球菌的特異基因作為靶序列，設計了兩對引物，對基因組DNA進行雙酶切后鏈接，優化反應條件，選擇適宜的反應液配方，建立了AFLP方法檢測肺炎鏈球菌。該方法靈敏度高，最低可檢測到1.5×103CFU/ml，與其他PCR快速診斷檢測水平相當［7，8］;特異度高，未出現假陰性和假陽性，本研究所用20株肺炎鏈球菌均能檢測出來，而15株非肺炎鏈球菌，包括金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌等革蘭陽性菌，也包括大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌，均未檢測出來，表明特異度高，并且電泳圖形具有一定的可識別性。

為了及時準確地檢測出疑似病例是否為肺炎鏈球菌感染，需要有靈敏特異的檢測方法。提取細菌DNA進行肺炎鏈球菌病原學的鑒定，尤其是與菌落形態與其相似的草綠色鏈球菌鑒別，是人們一直在尋找的方法。AFLP簡單、快速、敏感性好、特異性高，本研究AFLP條帶較多，特征性強，分辨率較高，能可靠地檢測出肺炎鏈球菌的同時，還可以分析出親緣關系，適合肺炎鏈球菌的早期診斷，尤其是無菌體液中的侵襲性感染，有著較大的診斷意義。

1 綦廷娜，王和，陳崢宏.肺炎鏈球菌L型對人淋巴細胞因子分泌刺激作用［J］.中國公共衛生，2010，26(5):610－611

2 Barzilay EJ，Brien KL，Kwok YS，et al.Could a single dose of pneumococcal conjugate vaccine in children be effective?Modeling the optimal age of vaccination［J］.Vaccine，2006，24(7):904－913

3 胡曉彥，桂炳東，王伶，等.BOX－PCR技術在肺炎鏈球菌的檢測中的應用［J］.實驗與檢驗醫學，2010，28(3):209－211

4 樊慧珍，于化鵬，黃文杰，等.DNA探針雜交快速檢測肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌［J］.第一軍醫大學學報，2005，12(10):1503－1505

5 Kalpoe JS，Templeton KE，Horrevorts AM，et al.Molecular typing of a suspected cluster of nocardia farcinica Infectionsby use of randomly amplified polymorphic DNA，pulsed－field gel electrophoresis，and amplified fragment length polymorphism analyses［J］.Journal of clinicalmicrobiology，2007，45(12):4048－4050

6 張順，蔡挺，陳琳，等.用AFLP分型和分子標記研究鮑曼不動桿菌院內感染傳播途徑［J］.現代實用醫學，2009，21(1):7－9

7 Dijkshoorn L.Typing acinetobacter strains:applications and methods［J］.Acinetobacter Biology and Pathogenesis，2009，1(20):85－88

8 胡農，蔡挺，張順，等.耐藥鮑曼不動桿菌擴增片段長度多態性分析指紋圖譜數據庫的建立［J］.浙江大學學報:醫學版，2007，36 (6):537－542