曲美他嗪對(duì)大鼠心力衰竭模型心肌能量代謝的干預(yù)

高 想 張鋒莉 唐艷芬 蔣鳳榮 姜衛(wèi)東 陶志強(qiáng)

2004年，Van Bilsen等［1］提出代謝重構(gòu)(metabolic remodeling)概念，指出由于心肌細(xì)胞糖類和脂肪等代謝紊亂，引起心臟能量代謝途徑的改變，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能異常。慢性心力衰竭常伴隨代謝重構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)從心肌能量代謝角度，研究代謝重構(gòu)與心力衰竭的關(guān)系，以及能量代謝藥物對(duì)心力衰竭的干預(yù)作用。

材料與方法

1.藥品與試劑:曲美他嗪(批號(hào):660104)，北京賽科藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，抗體由美國B＆R公司提供，引物由南京生物工程有限公司提供，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2.動(dòng)物造模與分組:SD大鼠，雄性，體重220±10g，共24只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供［許可證號(hào): SCXK(滬)2007－0005］。參照文獻(xiàn)采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備心臟壓力負(fù)荷超載心力衰竭模型［2］。主要步驟如下:SD大鼠以2%戊巴比妥鈉按30mg/kg腹腔麻醉，剪毛，開腹、分離暴露腹主動(dòng)脈，于雙側(cè)腎動(dòng)脈間分離腹主動(dòng)脈，用直徑為0.6mm的針灸針與腹主動(dòng)脈平行，1號(hào)線結(jié)扎固定，拔除針灸針，使腹主動(dòng)脈縮窄，依次縫合肌層和皮膚，術(shù)后腹腔注射0.1m l/d慶大霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組開腹暴露、分離腹主動(dòng)脈，但不進(jìn)行縮窄處理，其余步驟與模型組一致。實(shí)驗(yàn)分組:除正常(假手術(shù))組外，隨機(jī)分為模型組、曲美他嗪低劑量組和曲美他嗪高劑量組4組，所有動(dòng)物均常規(guī)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)在南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行［許可證號(hào):SYXK (蘇)2005－0009］。

3.給藥方法:正常組(n=6):手術(shù)分離腹主動(dòng)脈，不進(jìn)行縮窄處理，手術(shù)4周后雙蒸水灌胃，1次/日，連續(xù)4周。模型組(n=6):造模4周后，雙蒸水灌胃，1次/日，連續(xù)4周。曲美他嗪低劑量組(n=6):造模4周后，曲美他嗪5mg/kg，1次/日，用雙蒸水稀釋后灌胃，連續(xù)4周。曲美他嗪高劑量組(n= 6):造模4周后，曲美他嗪10mg/kg，1次/日，用雙蒸水稀釋后灌胃，連續(xù)4周。

4.觀察項(xiàng)目:(1)心臟超聲檢查:大鼠以10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉后備皮，應(yīng)用捷達(dá)超聲工作站測(cè)定室間隔(IVS)及左心室后壁厚度(LVPW)、左心室舒張期內(nèi)徑(LVD)和收縮期內(nèi)徑(LVS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短率(FS)。(2)電鏡:放血處死大鼠，取大鼠左心室心肌，2.5%戊二醛固定后送南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院檢測(cè)，電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化。(3)放射免疫法血清生化學(xué)檢測(cè):Ca2+－三磷酸腺苷酶(Ca2+－ATP)、游離脂肪酸(FFA)，按南京建成生物工程公司說明書進(jìn)行操作。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間差異采用單因素方差分析，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.超聲心動(dòng)圖:模型組IVS、LVPW、LVS、LVD明顯增大，LVEF、FS明顯下降;曲美他嗪治療后恢復(fù)，以高劑量組較明顯。提示曲美他嗪能改善大鼠心功能指標(biāo)(表1)。

表1 各組IVS、LVPW、LVS、LVD、LVEF、FS的變化(±s)

表1 各組IVS、LVPW、LVS、LVD、LVEF、FS的變化(±s)

與正常組比較，*P＞0.05，△P＜0.01，◇P＜0.001;與模型組比較，★P＜0.05，▲P＜0.01，◆P＜0.001

曲美他嗪高劑量組IVS(mm) 0.53±0.06 1.07±0.06△ 0.87±9.96 0.63±0.05測(cè)定指標(biāo) 正常組 模型組 模型+曲美他嗪低劑量組 模型+＊◆LVPW(mm) 0.57±0.06 1.13±0.06◇ 1.07±0.06 0.73±0.06＊▲LVS(mm) 0.57±0.06 0.93±0.06△ 0.83±0.05 0.73±0.05＊★L(fēng)VD(mm) 0.73±0.06 1.33±0.06◇ 1.23±0.06 0.87±0.06＊◆LVEF(%) 42.35±2.61 11.78±0.56◇ 10.12±2.49 27.75±1.83△▲FS(%) 17.76±2.15 4.27±0.22◇ 4.78±0.76 11.44±0.76△◆

2.電鏡:模型組大鼠心肌細(xì)胞肌絲排列紊亂，部分溶解，肌膜水腫，局部線粒體增多、腫脹，嵴消失，可見空泡結(jié)構(gòu);曲美他嗪治療后未見明顯肌絲溶解，肌膜水腫;線粒體增多，基質(zhì)正常(圖1)。

圖1 各組線粒體結(jié)構(gòu)變化A.正常組;B.模型組;C.模型+低劑量組;D.模型+高劑量組

3.心肌細(xì)胞能量代謝:模型組血清CA－ATP下調(diào)，F(xiàn)FA水平升高;曲美他嗪治療后與模型組比較，CA－ATP上調(diào)，F(xiàn)FA水平降低，提示心力衰竭時(shí)存在心肌細(xì)胞能量代謝異常，曲美他嗪能改善心肌細(xì)胞的能量代謝(表2)。

表2 各組CA－ATP、FFA的變化(ml/pg±s)

表2 各組CA－ATP、FFA的變化(ml/pg±s)

與正常組比較，*P＞0.05;與模型組比較，#P＜0.05

測(cè)定指標(biāo) 正常組 模型組 模型+曲美他嗪低劑量組 模型+曲美他嗪高劑量組CA－ATP 0.07±0.03 0.01±0.01* 0.02±0.02 0.04±0.01*# FFA 1.14±0.01 1.24±0.01* 1.22±0.05 1.16±0.05*#

討論

心臟能量代謝是保持心臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織結(jié)構(gòu)不斷更新的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)維持心臟功能具有重要意義。正常心肌細(xì)胞代謝所需能量的65%和30%分別由脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)和葡萄糖氧化提供。心力衰竭時(shí)心肌能量代謝底物利用變化，由優(yōu)先利用FA變?yōu)閮?yōu)先利用葡萄糖，導(dǎo)致游離脂肪酸(FFA)堆積，此時(shí)血漿兒茶酚胺類物質(zhì)濃度增高，除了對(duì)心肌組織有直接毒性作用，尚能增加β腎上腺素能受體介導(dǎo)的脂解作用，使能量消耗增加，脂肪儲(chǔ)存減少［3］。FFA能抑制線粒體、肌質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)酶體系活力，損傷線粒體功能和呼吸鏈，同時(shí)，心肌組織中FFA堆積可抑制糖酵解，使心肌能量代謝進(jìn)一步惡化，這種代謝重構(gòu)加重了心肌重構(gòu)，加劇了功能的惡化。因此，抑制交感神經(jīng)過度激活，逆轉(zhuǎn)心肌代謝底物轉(zhuǎn)換，改善代謝重構(gòu)，是CHF代謝治療的理論基礎(chǔ)［4］。

鈣離子跨膜內(nèi)流是形成心肌動(dòng)作電位不可或缺的環(huán)節(jié)，Ca2+作為一種細(xì)胞內(nèi)信使，能與心肌的肌鈣蛋白結(jié)合，激活收縮過程，因此在心肌的興奮－收縮偶聯(lián)過程中，Ca2+扮演著極其重要的角色。在生理情況下，通過肌膜ATP依賴性Ca泵的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)與Na+－Ca2+交換機(jī)制維持細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)。線粒體功能被抑制時(shí)ATP合成障礙，細(xì)胞膜、肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+－ATP酶甚或Na+－K+ATP酶活性下降，胞膜主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)障礙，胞內(nèi)Ca2+、Na+增加，后者通過Na+－Ca2+交換進(jìn)一步增加胞內(nèi)Ca2+含量，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷，從而進(jìn)一步影響心功能。在心力衰竭模型中，心肌收縮功能的降低主要是由于肌質(zhì)網(wǎng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+循環(huán)調(diào)控障礙［5］。

本研究采用SD大鼠主動(dòng)脈縮窄法制作心力衰竭模型，模型組心功能明顯下降;電鏡下心肌細(xì)胞肌絲排列紊亂，出現(xiàn)部分肌絲溶解，肌膜水腫，局部線粒體增多、腫脹，嵴消失，可見空泡結(jié)構(gòu);CA－ATP下調(diào)，F(xiàn)FA水平升高，表明心力衰竭時(shí)存在心肌細(xì)胞能量代謝的異常。曲美他嗪治療組能上調(diào)CA－ATP，降低FFA水平，具有改善心肌能量代謝的作用，從而改善心力衰竭大鼠模型的心功能。曲美他嗪是一種具有獨(dú)特作用機(jī)制的抗心肌缺血藥物，其細(xì)胞保護(hù)作用通過直接抑制線粒體長鏈3－酮酰輔酶A硫解酶(3－KAT)實(shí)現(xiàn)，在心肌缺血時(shí)葡萄糖裂解ATP的再合成中氧需減少，優(yōu)化心肌細(xì)胞的能量產(chǎn)生，并可維持暴露于缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的生長及ATP的含量，保持電活動(dòng)的穩(wěn)定性，減少缺血性攣縮，促進(jìn)心肌細(xì)胞功能恢復(fù)，為傳統(tǒng)心力衰竭治療提供了獨(dú)特的補(bǔ)充和擴(kuò)展［6］，龔韌等［7］對(duì)曲美他嗪治療擴(kuò)張性心肌病進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明患者6min步行距離增加，左心室射血分?jǐn)?shù)優(yōu)于對(duì)照，且明顯縮小左心室舒張末期內(nèi)徑。對(duì)于心肌細(xì)胞的能量代謝變化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及形態(tài)變化相關(guān)的分子機(jī)制等有待進(jìn)一步深入研究。

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7 龔韌，黃曉，吳延慶.曲美他嗪治療擴(kuò)張型心肌病的Meta分析［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(2):368－372