木丹顆粒對(duì)糖尿病大鼠血清致痛物質(zhì)5-HT、β-EP 的影響

李長(zhǎng)輝，于世家

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2009級(jí)博士研究生班，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)?？疲|寧 沈陽(yáng) 110032）

木丹顆粒對(duì)糖尿病大鼠血清致痛物質(zhì)5-HT、β-EP 的影響

李長(zhǎng)輝1，于世家2

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2009級(jí)博士研究生班，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)?？疲|寧 沈陽(yáng) 110032）

目的 觀察木丹顆粒對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠血清致痛物質(zhì)五羥色胺（5-HT）、β內(nèi)啡肽(β-EP)的影響。方法 采用鏈脲佐菌素腹腔注射制作糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠模型，給予木丹顆粒灌胃，以苯妥英鈉為陽(yáng)性對(duì)照組，并設(shè)正常組及模型組，觀察給藥前后大鼠血清5-HT、β-EP的變化。結(jié)果 木丹顆粒組和苯妥英鈉組血清中5-HT水平與模型組比較在2、4、8周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯下降，β-EP水平升高（均P<0.01）；血清中5-HT水平在2、4、8周時(shí)苯妥英鈉組明顯高于木丹顆粒組（P<0.05，P<0.01）；血清中β-EP水平在2、4、8周時(shí)苯妥英鈉組與木丹顆粒組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。結(jié)論 木丹顆粒與苯妥英鈉均能降低糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠模型血清中5-HT水平，升高β-EP的水平，且控制5-HT的水平要優(yōu)于苯妥英鈉。

木丹顆粒；糖尿病周圍神經(jīng)病變；五羥色胺；β內(nèi)啡肽；延胡索；當(dāng)歸；蘇木；大鼠

糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中其發(fā)病率可高達(dá)60%～90%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，60%～70%糖尿病足部潰瘍最初表現(xiàn)為糖尿病神經(jīng)病變，研究疼痛的國(guó)際權(quán)威Melzack和Wall曾寫到：“疼痛是一個(gè)沒有國(guó)界的重大問題，解決這個(gè)難題需要世界范圍的共同努力。”而每年在DPN及其相關(guān)并發(fā)癥的治療方面大約需要10.91億美元，給社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。木丹顆粒組方以益氣活血法為原則，主要由延胡索、當(dāng)歸、蘇木等7味藥組成。臨床中用于改善糖尿病患者的并發(fā)癥的治療[3]。本課題組經(jīng)過長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用證實(shí)為防治糖尿病周圍神經(jīng)病變的有效方劑。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上，以糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠為研究對(duì)象，觀察木丹顆粒對(duì)其神經(jīng)損傷的影響，并探討其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠180只，體質(zhì)量200～250 g。中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)，scxk(遼)2008-0005。

1.1.2 藥物 木丹顆粒劑制備提取物，每克提取物相當(dāng)于4.28 g生藥，由營(yíng)口奧達(dá)制藥有限公司提供，批號(hào):91250；苯妥英鈉50 mg/片，購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.1.3 試劑 鏈脲佐菌素(St reptozotocin，STZ)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒購(gòu)自上海億欣生物科技有限公司。

1.1.4 儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，HH·B11·500型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。微量移液器，美國(guó)熱電公司生產(chǎn)。酶標(biāo)儀，anthos2010型。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 健康雄性Wistar大鼠180只，體質(zhì)量200～250 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量層次隨機(jī)取45只，分3組，分別為2、4、8周正常組(每組15只)，135只造模，將造模成功后的大鼠，按血糖層次隨機(jī)分為2、4、8周模型組、木丹顆粒組、苯妥英鈉組每組45只，再分為2、4、8周，每周15只。各組血糖值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示各組大鼠血糖水平是一致的。

1.2.2 動(dòng)物造模 參照Sally等方法，造模前禁食12 h，單次腹腔內(nèi)注射2%鏈脲佐菌素溶液(Streptozotocin，STZ)53 mg/kg(pH 4.2的 0.1 mol/L枸椽酸緩沖液配制)誘發(fā)糖尿病72 h后通過強(qiáng)生穩(wěn)步型血糖儀測(cè)定大鼠尾靜脈血血糖，血糖大于16.7 mmol/L者列入觀察對(duì)象，正常組24只大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射相等容積0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液，實(shí)驗(yàn)期間全部大鼠予普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.2.2 給藥方法 木丹顆粒組 按 10 mL/（kg·d）（每毫升藥液含生藥0.23 g）灌胃。苯妥英鈉組按10 mL/（kg·d）灌胃，用時(shí)壓碎用溫開水配成混懸液（1.25 mg/mL）。給藥劑量均按75 kg成人體表面積換算，每天灌胃1次，木丹顆粒組大鼠灌胃濃度為1.48 g/kg，苯妥英納組灌胃濃度苯妥英鈉為0.002 5 g/kg，空白組及模型組予生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃。以上各組均從第17天開始每天給藥1次至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.3 血糖檢測(cè) 分別于給藥前0、給藥后2、4、8周尾靜脈取血，用美國(guó)強(qiáng)生公司穩(wěn)步型血糖儀測(cè)定。

1.2.4 ELISA法檢測(cè) 木丹顆粒對(duì)痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠血清致痛物質(zhì)5-羥色胺（5-HT）、內(nèi)啡呔（β-EP）的影響。其程序是：①包被；②加樣；③加酶標(biāo)抗體；④加底物液顯色；⑤終止反應(yīng)；⑥結(jié)果判定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 木丹顆粒對(duì)糖尿病大鼠模型血糖的影響

與空白組比較，模型組、木丹組、苯妥英鈉組空腹血糖濃度升高（P＜0.01），與模型組、苯妥英鈉組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 木丹顆粒對(duì)糖尿病大鼠模型血糖的影響（n=17，）

表1 木丹顆粒對(duì)糖尿病大鼠模型血糖的影響（n=17，）

注：與空白組細(xì)弱**P<0.01。

組 別空白組模型組苯妥英鈉組木丹顆粒組藥物劑量（g/kg）— —0.002 5 1.48藥物血糖（mmol/L）7.24±1.8 20.39±2.33**21.04±2.21 21.3±1.92

2.2 木丹顆粒對(duì)糖尿病大鼠模型血清中5-HT和β-EP水平的影響

造模后的2、4、8周時(shí)血清中5-HT水平明顯高于空白對(duì)照組，且呈上升趨勢(shì)，明顯低于空白組；與模型組比較在2、4、8周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)木丹顆粒組和苯妥英鈉組血清中5-HT明顯降低（P<0.01），β-EP水平明顯升高（P<0.01）。 血清中5-HT水平在2、4、8周時(shí)苯妥英鈉組明顯高于木丹顆粒組（P<0.05，P<0.01）；血清中 β-EP 水平在 2、4、8周時(shí)苯妥英鈉組與木丹顆粒組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表 2。

表2 木丹顆粒對(duì)糖尿病大鼠模型2、4、8周3個(gè)時(shí)間血清中 5-HT 和 β-EP 的影響 （n=15，）

表2 木丹顆粒對(duì)糖尿病大鼠模型2、4、8周3個(gè)時(shí)間血清中 5-HT 和 β-EP 的影響 （n=15，）

注：與空白組比較**P<0.01；與同周模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；與同周木丹顆粒組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組 別空白組模型組（2周）模型組（4周）模型組（8周）木丹組（2周）木丹組（4周）木丹組（8周）苯妥英鈉組（2周）苯妥英鈉組（4周）苯妥英鈉組（8周）藥物劑量（g/kg）— —1.48 1.48 1.48 0.002 5 0.002 5 0.002 5 5-HT 23.85±1.96 57.68±3.13**91.14±5.77**104.89±4.52**48.32±2.06**△△40.80±1.99**△△35.27±1.67**△△53.72±2.70**△▲▲44.21±2.18**△△▲39.93±1.85**△△▲▲β-EP 48.35±2.12 16.36±0.79**13.07±0.82**11.62±0.52**19.97±0.74**△△22.60±0.89**△△24.28±0.55**△△19.51±0.74**△△22.72±0.57**△△24.67±0.77**△△

3 討論

疼痛是糖尿病周圍神經(jīng)病變的主要表現(xiàn)，而β-EP和5-HT被認(rèn)為是主要的致痛物質(zhì)。β-EP是體內(nèi)最重要的內(nèi)源性阿片肽，主要作用于-阿片受體而產(chǎn)生抗傷害性感受或鎮(zhèn)痛作用[4]。已有研究表明[5]β-EP與疼痛關(guān)系最為密切，內(nèi)源性阿片肽參與抗傷害感受或鎮(zhèn)痛作用，它們?cè)谘仔蕴弁吹目刂浦衅鹬匾淖饔谩４竽X內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)的重要物質(zhì)，也是一種很強(qiáng)的致痛物質(zhì)，它與鎮(zhèn)痛作用密切相關(guān)，其中5-HT是一種公認(rèn)的具有鎮(zhèn)痛作用的神經(jīng)遞質(zhì)，與外周疼痛傳導(dǎo)以及子宮收縮有關(guān)，對(duì)子宮、內(nèi)臟及外周血管平滑肌有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。它參與脊髓水平下行傷害性刺激的調(diào)控，通過5-HT受體的作用共同阻抗傷害性沖動(dòng)的傳導(dǎo)，從而降低機(jī)體對(duì)疼痛的敏感性[6-7]。

苯妥英鈉傳統(tǒng)上被作為無過度鎮(zhèn)靜作用的抗癲癇藥廣泛使用，近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)苯妥英鈉的很多新作用，如鎮(zhèn)痛。苯妥英鈉作為生物電調(diào)節(jié)劑，不僅對(duì)外周神經(jīng)細(xì)胞膜有穩(wěn)定作用，而且能調(diào)節(jié)大腦多種神經(jīng)遞質(zhì)，如阻斷NMDA受體，避免神經(jīng)元過度興奮；增加大腦抑制性遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）濃度；阻止5-羥色胺再攝取，從而增加大腦神經(jīng)突觸間隙5-羥色胺的濃度等[8]，通過多種途徑抑制受損的感覺神經(jīng)元的異常放電及異常傳導(dǎo)，從而減輕神經(jīng)性疼痛；且小劑量使用苯妥英鈉耐受性好，無依賴性。另外，可通過改善伴隨的或潛在的抑郁產(chǎn)生更廣泛的鎮(zhèn)靜及抗焦慮作用提高疼痛耐受性[9-10]?？挂钟羲幬飳?duì)沒有抑郁的患者同樣具有止痛作用，是與內(nèi)啡肽、內(nèi)源性鴉片類物質(zhì)有關(guān)[11]。

糖尿病周圍神經(jīng)病變乃糖尿病遷延日久所致，所謂 “久病必虛”、“久病入絡(luò)”，在一味攻邪的基礎(chǔ)上，當(dāng)不忘補(bǔ)虛，扶正入絡(luò)，以整體觀念和辨證論治為核心，在臨床治療中止痛往往是必要的，但是能將辨病與辨證相結(jié)合，從糖尿病周圍神經(jīng)病變的氣血、陰陽(yáng)、臟腑和痰瘀等[12]病機(jī)入手，益氣活血止痛時(shí)疼痛能從根本上得到控制。木丹顆粒是益氣活血法代表藥物，方中以延胡索辛溫活血、利氣止通;配以蘇木、雞血藤、紅花、沒藥、丹參，增強(qiáng)活血化瘀之力，配赤芍、三七，又可助活血止痛；用當(dāng)歸意在活血、養(yǎng)血，達(dá)到祛瘀生新的功效。研究顯示木丹顆粒和苯妥英鈉均具有明顯減低糖尿病大鼠模型血清中5-HT，升高β-EP的水平，且在遠(yuǎn)期控制5-HT水平要優(yōu)于苯妥英鈉。為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。木丹顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機(jī)制我們將會(huì)從其他方面繼續(xù)研究。

[1]Adam Gordois，Paul Scuffham.The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the U.S[J].Diabetes Care， 2003，26(6)：1 790-1 795.

[2]Sinnreich M， Taylor B V， Dyck P J.Diabeticneuropathies Classification clinical features and pathophysiological basis[J].Neurologist，2005，11(2):63-79.

[3]張 蘭，于世家.從絡(luò)病理論探討糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生機(jī)制[J].中醫(yī)藥研究，2002，4（18）：2.

[4]Lee H J， Lee J H， Lee E O， et al.Substance P and bet a end orphan mediate electroacupuncture in duced analgesic activity in mouse can cer pain model[J].Acupunct Electrother Res，2009（34）:27-40.

[5]程海波，陳敏敏，許惠琴，等.癌痛平膠囊對(duì)福爾馬林致痛大鼠下丘腦、垂體、腰髓中NO、β-EP含量的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（2）：123-124.

[6]Toaro R， matteis G D， Marin C， et al.Sumatriptan and cerebral blood flow velocity change during migraine attacks[J].Headache，1997，37(10):635-637.

[7]Saper J R.Diagnosis and symptomatic treatment of migraine[J].Headache，1997，37(1):14-16.

[8]喻東山.苯妥英鈉的精神科應(yīng)用[J].四川精神衛(wèi)生，2007，20（3）：186.

[9]駱艷麗，吳文源.慢性疼痛藥物治療的研究進(jìn)展[J].上海鐵道大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)輯)，2000，21（11）：87-88.

[10]Ansar A.The efficacy of newer antidepressants in the treatment of chronic pain:a review of current literature[J].Harv rev psychiatry，2000（7）：257-277.

[11]吳 波，何 俐.非抗癲癇藥物治療特發(fā)性三叉神經(jīng)痛進(jìn)展[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2000，7（19）：46.

[12]季聚良.中醫(yī)藥防治糖尿病周圍神經(jīng)病變機(jī)制研究概況[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（2）：76-77.

（本文編輯 彭芝配）

Effects of Mudan particles on serum 5-HT and β-EP expressions in diabetic rats

LI Chang-hui，YU Shi-jia
(TCM University of Liaoning， Shenyang， Liaoning 110032， China)

Objective To observe the effects of Mudan particles on serum 5-Hydroxytryptamine(5-HT)and beta endorphin(beta-EP)in rats with diabetic peripheral neuropathy(DPN).Methods The DPN model in rats were established by injected intraperitoneally with Streptozotocin.Then,these rats were divided into the Mudan particles group， phenytoin sodium positive control group and model control group.Normal rats were selected as blank control group.The expression levels of serum 5-HT and beta-EP were examined in all these rats.Results Compared with the model group,serum 5-HT levels in Mudan particle group and phenytoin sodium group in 2W， 4W， 8W three time points were decreased significantly while β-EP levels were increased significantly(P<0.01).And serum 5-HT levels in phenytoin sodium group were higher than those in Mudan particle group(P<0.05，P<0.01).There were no significant differences in β-EP levels between the two groups(P>0.05).Conclusion The Mudan particles and phenytoin sodium can reduce serum 5-HT levels and increase β-EP levels in DPN rats， and the effects of Mudan particles on 5-HT is superior to that of phenytoin sodium.

Mudan particles； diabetic peripheral neuropathy rats； 5-Hydroxytryptamine；beta endorphin

李長(zhǎng)輝(1975-)，男，遼寧沈陽(yáng)人，博士研究生，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治研究。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.05.005.025.03

2012－04－10

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目（81072912）。