校準曲線的制作及有關問題的探討

蔡裕豐，吳春妍

(啟東市環境監測站，江蘇 啟東 226200)

環境監測中的樣品分析主要包括滴定分析、稱量分析、分光光度分析、儀器分析和生物分析等方法。其中分光光度分析和絕大部分的儀器分析都需通過制作校準曲線來進行樣品分析。筆者在日常的質量督查中發現，不少分析人員特別是新上崗人員對于如何制作和使用校準曲線存在許多問題，而現行的監測分析方法又沒有詳細的介紹。對此，筆者結合多年工作經驗，并參閱有關文獻，就校準曲線的制作和有關問題作一系統的探討。

1 校準曲線的定義及制作

校準曲線是指描述待測物質濃度或量與相應的測量儀器響應量或其它指示量之間的定量關系的曲線［1］。制作好校準曲線是取得準確測量結果的基礎。校準曲線為該分析方法的直線范圍，根據方法的測量范圍，配制一系列濃度的標準溶液，較均勻分布在測量范圍內。系列點 (包括零濃度點)至少應有6個。最低點和最高點要相差一個數量級，每個濃度點作平行測定，取平均值，減去空白值后包括零濃度點用最小二乘法進行回歸，取得回歸方程y=a+bx，x一般為μg或μg/ml。校準曲線的制作應與樣品分析同時進行。

2 校準曲線的空白試驗、相關系數、截距、斜率和線性范圍的要求、影響因素

空白試驗:在制作校準曲線時必須同時作兩個空白試驗。空白試驗是除用水代替樣品外，其它所加試劑和操作步驟均與樣品測定完全相同的操作過程。試驗用水、試劑質量、器皿、實驗室環境及操作過程中的沾污等因素都影響空白試驗的測定值(即空白值)。這些影響因素控制好后，每個分析項目的空白值均會在一定范圍內波動。一般來說，空白值越小越好。如空白值出現異常，會影響測定結果的準確度，應從上述幾方面尋找原因。

相關系數 (γ):表示校準曲線的精密度，分光光度法要求γ≥0.999，否則應查找原因加以糾正，重新制作合格的校準曲線。某些分析項目，由于含量很低或操作中的影響因素較多，如原子吸收中的石墨爐分析，某些氣相色譜項目，相關系數可適當放寬，要求γ≥0.99。

截距 (a):表示校準曲線的準確度。影響因素包括容量器具，光度測量儀器的誤差 (比色皿的成套性，非單色光引起的偏差，儀器的線性等)、操作誤差等，也有方法本身的因素［2］。一般要求a≤0.005，當a＞0.005時，應作截距的顯著性檢驗。A要求保留到小數點后第三位，至少有一位有效數字。

斜率 (b):表示校準曲線的靈敏度。它除了受方法的靈敏度影響外，還與顯色反應條件 (如環境溫度、顯色溫度、試驗用水、試劑質量、顯色溶液的pH值)、標準溶液的準確度、測量儀器的靈敏度、波長的準確度以及分析人員的操作水平等有較大關系。上述這些影響因素控制好，大多數分析項目的斜率能保持在一定的范圍內，通常不超過相對偏差2.5%。當發現斜率上移或下降，超出了范圍，應從各影響因素中查找。

線性范圍:是某分析方法校準曲線的直線部分所對應的待測物質濃度或量的變化范圍。線性范圍內標準點的吸光度 (A)應控制在0.010～0.080以內，其測量誤差較小。同時線性范圍不能任意外推。如樣品的吸光度超出了線性范圍，要重新取樣測定。

3 標準曲線與工作曲線的區別

校準曲線包括標準曲線和工作曲線。取不同含量標準溶液，直接加入試劑，顯色后進行測定，得出濃度值與信號值的線性關系稱為標準曲線。而取不同量標準溶液，經過與樣品分析相同的前處理步驟 (如蒸餾、消解、水浴、萃取、振蕩等)，由此得出濃度值與信號值之間的線性關系稱為工作曲線。如經過試驗證實，標準溶液系列在省略部分操作步驟時，直接測量的響應值與全部操作步驟具有一致結果時，可允許省略步驟。總磷［3］、總鉻［4］、總鐵［5］的工作曲線與標準曲線經實驗證實，其斜率間無顯著性差異，可以直接使用標準曲線，而對于揮發酚、總氰化物的測定，其工作曲線與標準曲線相比，斜率有所下降，使用標準曲線，結果偏低，因此必須使用工作曲線［6］。

4 校準曲線使用中的注意事項

對于校準曲線斜率穩定的分析項目，批間誤差較小，在樣品分析中可以使用原校準曲線，但應在樣品分析同時，帶兩個空白試驗和一個中間標準點。中間標準點測定值與標準曲線相應點濃度的相對誤差不超過10%，否則應重新制作校準曲線。盡管如此，校準曲線也應兩個月制作一次。在比色分析中，當儀器條件發生變化 (如調換光源燈泡，儀器波長校正，或儀器經過維修等因素)、標準溶液新配制時，標準曲線也應重新制作。一些儀器如原子熒光、原子吸收、氣相色譜、離子色譜等分析的所有項目，因每次測試條件不可能完全相同，要求每次樣品分析都要制作校準曲線。

表1 一些常規分析項目校準曲線的斜率范圍

5 部分常規分析項目的空白吸光度、斜率范圍，以及在質控中的應用

筆者參考有關文獻［7，8］，歸納整理了日常分析中21個項目的空白試驗吸光度和標準曲線斜率的范圍，見表1。對分析人員特別是新上崗人員有較好的參考價值。如分析中空白試驗的吸光度出現了異常，校準曲線的斜率達不到要求，都要逐一尋找原因，直到符合要求為止。

筆者曾用火焰原子吸收法測定土壤中的銅、鎘、鉛、鋅、鎳，發現這幾個項目的空白值都出現不同程度的升高，特別是鋅空白值更高。對此現象，進行了詳細分析，認為導致空白值升高的原因主要為:①實驗用水和消解樣品試劑純度不高;②所用器皿被沾污;③消解過程中樣品被塵埃污染;④氫氟酸加入方法不當;⑤消解過程中趕酸不完全。針對上述原因，逐一加以改進，使空白值達到正常水平。再如用4－AAP萃取光度法測定揮發酚時，校準曲線的斜率偏低，應從以下幾方面尋找原因:①實驗用水是否為無酚水;②苯酚標準溶液的濃度是否準確，因1.00μg/ml的苯酚標準使用液不穩定，配制后2h內使用;③緩沖溶液的pH是否達到要求。因氨－氯化銨緩沖溶液揮發性很大，應定期測定pH值，發現pH不在10.0±0.2范圍內，要重新配制;④4－氨基安替比林的提純和配制方法是否準確。因該試劑易吸潮結塊并被氧化，常用CHCL3提純，如CHCL3用量過大，使該試劑的濃度低于2%;⑤CHCL3的加入量是否準確，CHCL3比重較大且易揮發，要使CHCL3的加入量盡量準確;⑥萃取操作中的萃取頻率和萃取時間要一致，確保萃取完全。

校準曲線的制作是個較為復雜的系統工程，各種影響因素錯綜復雜，例如實驗用水不僅能引起空白值的偏高，也可能引起截距和斜率的變化。而且每個分析項目的影響因素又不完全相同，因此要求每個分析人員具體問題具體分析，在制作校準曲線時，勤于思考，認真操作，精益求精。

［1］國家環境保護總局《水和廢水監測分析方法》編委會．水和廢水監測分析方法 (4版) ［M］．北京:中國環境科學出版社，2003，80－81．

［2］沈叔平．試析環境監測分析中的質量保證［J］．環境監測管理與技術，1992，4(2):45－49．

［3］劉成梅，陳黎軍．過硫酸鉀消解測定水中總磷標準曲線制備的簡化［J］．環境監測管理與技術，1998，10(4):41．

［4］黃蓉蓉．測定水中總鉻校準曲線制備的簡化 ［J］．環境監測管理與技術，2000，12(5):39．

［5］蔡裕豐．鄰菲啰啉直接光度法測定水中總鐵 ［J］．環境科學導刊，2009，28(3):104－106．

［6］金筱青．標準曲線與工作曲線在不同分析方法中的使用［J］．環境監測管理與技術，2005，17(4):45．

［7］袁敏、崔桂賢．水質檢測項目空白值及校準曲線a、b值參考表［J］．環境監測管理與技術，2008，20(6):69－70．

［8］本書編委會．空氣和廢氣監測分析方法 (4版) ［M］．北京:中國環境科學出版社，2007，112－127．