超聲波均質化對仙臺病毒ELISA測試中抗原穩定性的影響

向志光，劉先菊，佟 巍，李雨函，張麗芳，魏 強

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學實驗動物研究所，衛生部實驗動物檢測中心，北京 100021)

仙臺病毒是實驗用大小鼠嚴格控制的病原體，在我國的實驗動物國家標準中對用清潔級以上的實驗用大小鼠均需要排除該病原體的干擾［1］，并且確定以血清學檢測實驗動物自身攜帶的抗病毒抗體水平以評價實驗動物的質量。目前對于仙臺病毒的血清學檢測的ELISA方法中多使用病毒的天然抗原，因為天然抗原更具有代表性。但是目前對于各類獲取的天然病毒抗原的均質化處理，以及天然抗原對于酶標板的吸附性狀的研究較少。

本文報道了我中心采用BHK-21細胞擴增仙臺病毒，使用差速離心去除了培養細胞碎片，富集了仙臺病毒。對收集的仙臺病毒采用超聲波進行均質化處理，和未處理的病毒顆粒做比較包被酶標板，用仙臺病毒的免疫血清在兩種平板做測試，通過比較測試數據的變異率分析了超聲波處理對于酶標板包被抗原的均質性和抗原穩定性的影響。

1 材料和方法

1.1 病毒、細胞、質控血清的來源

仙臺病毒和BHK-21細胞來自美國ATCC。SPF小鼠血清采自北京華阜康生物技術有限公司提供的6～8周齡SPF級實驗小鼠外周血。免疫質控血清按照本中心之前報道的方法進行制備［2］。

1.2 病毒的擴增和濃縮純化

使用仙臺病毒接種感染BHK-21細胞，感染3d后收集培養物經-80℃至室溫的反復凍融3次，后經56℃水浴30min對仙臺病毒滅活處理。培養物經4℃ 10000r/m in離心30min去除細胞碎片，收集上清經4℃ 35000r/min離心3h收集沉淀病毒顆粒。使用生理鹽水反復吹打沉淀物至呈均勻分散相，使用12000r/min 30min低溫離心去除結塊不溶物。使用BCA法測定蛋白濃度。

1.3 病毒的超聲波處理

取濃度為3mg/m L病毒重懸物1m L，放置冰上，使用小探頭進行超聲處理，超聲頻率為20kHz，振幅30%，功率設定在300W。超聲處理5s，停10s，連續處理60次。將超聲處理后的病毒再次進行12000r/min 30min低溫離心，去除不溶物，再次用BCA法測定蛋白濃度。

1.4 酶標板的包被和血清樣品的檢測

將未經超聲處理的仙臺病毒抗原和超聲處理的抗原按照1μg/m L的濃度重懸于包被液，按照每孔100μL包被酶標板，4℃包被過夜，室溫封閉后加入待測試樣品37℃孵育1h。使用PBST洗板3次后加入酶標記物(1∶20000稀釋的rabbit anti-mouse IgG-HRP)37℃孵育1h。使用PBST洗板3次后加入TMB底物液，10min內加入2M H2SO4終止顯色反應。至A450進行檢測。

1.5 變異系數(變異率)的計算

對標準免疫血清做梯度稀釋至從1∶40至1∶2560，每個稀釋度重復測試6個孔。2份 SPF血清也進行6個孔的重復測試。對各樣品做均值和標準差的統計，測定變異系數，以標準差/均值 ×100%做變異率統計。

2 結果

2.1 超聲處理對仙臺病毒抗原的抗原性無顯著影響

各血清樣品在2種平板A450的測量均值如圖1所示。SeV的免疫小鼠血清稀釋至1∶40、1∶80、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560，測量數值在2種平板的測量值均逐漸下降，多次測量此種趨勢一致。2份SPF小鼠血清(NC1和NC2)的測量值在0.2以下。在超聲處理的SeV病毒抗原包被平板中各樣品的測量值均低于其在未經超聲處理抗原平板的數據，但差異較小，超聲處理未能顯著影響仙臺病毒抗原的抗原性。

圖1 梯度稀釋SeV免疫血清(P)和SPF血清(NC)在兩種抗原平板的A450檢測均值Fig.1 The average A450of gradient diluted SeV-immunizedserum(P)and SPF sera(NC)in the two kinds of plates

2.2 超聲處理抗原包被平板同一樣品檢測孔間變異率較小

各血清樣品在2種平板A450的測量均的變異率(%)如圖2所示。各梯度小鼠免疫血清樣品在未經超聲處理仙臺病毒抗原包被ELISA檢測中測量值的變異率在1.97%～6.02%之間；在經超聲處理仙臺病毒抗原包被ELISA檢測中測量值的變異率在0.53%～2.26%之間；2份SPF小鼠血清在未經超聲處理的平板的測量值變異率為 6.81%和7.46%，在超聲處理的平板的測量值變異率為2.79%和 4.34%，均高于免疫血清測量值的變異率；但所有樣品在經超聲處理的病毒抗原包被ELISA檢測中測量值的變異率均較小。

圖2 各血清樣品在2種平板A450測量值的變異率(%)Fig.2 The coefficient of variation(CV%)of the tested samp les(A450)in the two kinds of plates

3 討論

酶聯免疫吸附實驗(ELISA)在實驗動物的病原學檢測中主要是利用病毒抗原包被在酶標板孔的底面，以吸附的抗原物質檢測待檢血清樣品中抗病毒的抗體水平，因此病毒抗原的抗原性、抗原和酶標板底面的吸附性、抗原包被的劑量和檢測抗體的容量等都是影響ELISA檢測方法準確性的關鍵因素。因此尋找病原體特異性的抗原是首要因素，在小鼠的仙臺病毒ELISA檢測試劑盒的設計上我們依然選擇病毒的天然抗原作為抗原物質進行包被，這樣就排除了使用重組表達抗原漏檢的可能性［3］。我們對仙臺病毒的雞胚培養物和BHK-21細胞培養物做了比較，發現細胞培養物的仙臺病毒經后續純化后抗原純度更高，對后續實驗的影響較小(數據未報道)，通過抗原交叉實驗確定了最佳抗原包被劑量(另文報道)。但是仙臺病毒細胞培養物自身的結構狀態以及其與酶標板底面的吸附性狀仍需關注。

仙臺病毒是單鏈 RNA病毒，病毒粒子多呈圓形，直徑130～250nm［4］。作為副粘病毒，其與細胞組分的粘附特性值得關注。仙臺病毒差速離心后，沉淀物重新懸起需要借助外力，加樣器槍頭吹打的機械剪切力對沉淀物混勻的效果不佳。使用電動勻漿器對沉淀進行勻漿，可以使得沉淀物成為均勻分散相，但進行12000r/min的再次離心仍然會有沉淀物存在。這表明差速離心收集的沉淀物中仍有較大團塊狀物質，這可能是病毒的聚集體，也有可能是病毒與細胞碎片粘附的團塊。這些較大的顆粒狀物質在酶標板上的吸附穩定性較差，使用同一血清樣品在同一酶標板的不同孔中讀出的數值偏差較大，即使進行了再次的高速離心這種團塊效應依然存在。

超聲波細胞破碎技術是對生物物質均質化的另一選擇。超聲對細胞等生物物質的熱效應、空化效應和機械效應可以更好的打開病毒顆粒之間、病毒與細胞碎片之間的粘附，對沉淀物的均質化有一定作用［5］。本文報道了使用超聲波對沉淀物質進行均質化處理，結果可以看出此處理降低了抗原的團塊效應對于抗原與酶標板吸附的影響，降低了同一樣品在不同孔之間檢測數值的變異率，提高了酶標板吸附抗原的穩定性。

［1］實驗動物微生物學等級及監測［S］.GB14922.2-2001.

［2］侯麗波，謝軍芳，佟巍，等.小鼠仙臺病毒標準化血清的制備及鑒定［J］.中國比較醫學雜志，2008，18(9)：57-59.

［3］Wan CH，Riley MI，Hook RR，et al.Expression of Sendai virus nucleocapsid protein in a baculovirus expression system and application to diagnostic assays for Sendai virus infection［J］.J Clin Microbiol.1995，33(8)：2007-2011.

［4］Megumi T，Nishikawa R，Fujita S，et al.Absorption spectra of viral components of Sendai virus in the wavelength region from 130to 320nm［J］.J Photochem Photobiol B.1991，10(1-2)：79-89.

［5］de Oliveira MZ，Vale V，Keid L，et al.Validation of an ELISA method for the serological diagnosis of canine brucellosis due to Brucella canis［J］.Res Vet Sci.2011，90(3)：425-31.