河豚毒素中和性單抗的制備、鑒定及TTX檢測方法的建立

郭建巍，王珍光，張 云，張雅芳，趙強元，馬 聰

(海軍總醫院檢驗科，北京 100048)

河豚毒素 (tetrodotoxin，TTX)是一種重要的海洋生物毒素，廣泛存在于海洋生物和陸棲等眾多生物中，并可通過食物鏈富集等途徑污染其它水產品，TTX中毒屢有發生，死亡率達40%以上。作為一種潛在的軍用毒劑，TTX已被列入國際生物安全公約清單［1］。目前針對 TTX中毒，國內外還沒有適用于人體的專用特效藥［2，3］，因此建立和發展具有自主知識產權的抗體制劑及檢測方法具有非常重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

河豚毒素(購于河北省水產研究所)；HT、HAT、PEG1500購自Sigma公司；18g～20g Balb/c小鼠由海軍總醫院實驗動物中心提供；新生小牛血清購自北京元亨圣馬生物技術研究所；HRP(RZ≥3.1)及四甲基聯苯胺(TMB)為Sigma公司產品；HRP標記的羊抗小鼠抗體(GAM-HRP)由本室制備；Protein A層析柱購自 Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原的制備：河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)15mg溶于pH 5.0的檸檬酸緩沖液中，緩慢滴加到15mg KLH/0.01mol/L PBS溶液中，調pH至7.0，冰浴下加入1%戊二醛3m L，室溫反應1.5h，用0.01mol/L PBS 4℃透析48h，檢測蛋白定量，既得TTX-KLH復合物即免疫原，分裝后-20℃保存。1.2.2 檢測用抗原的制備：河豚毒素10mg溶于pH 5.0的檸檬酸緩沖液中，將此溶液緩慢滴加到10mg BSA/0.01mol/L PBS溶液中，調pH至7.0，冰浴下加入1%戊二醛3m L，室溫反應1.5h，用0.01mol/L PBS 4℃進行透析48h，既得 TTX-BSA復合物，分裝后-20℃保存。

1.2.3 抗 TTX單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建、篩選和鑒定：選用4～6周齡的雌性 Balb/c小鼠6只，分別用12.5μg TTX-KLH對小鼠腹股溝皮下多點注射免疫，每3周免疫1次，共免疫4次，常規方法融合。用 TTX-BSA間接 ELISA篩選 ，陽性細胞反復亞克隆直到所有雜交瘤細胞培養上清檢測為100%陽性。于Balb/c小鼠腹腔接種雜交瘤細胞誘生腹水，protein A sepharose CL4B親和柱純化，SDS-PAGE、間接ELISA鑒定。

1.2.4 抗TTX單抗的中和活性測定：選用4～6周齡的昆明小鼠100只，雌雄各半，將TTX用雙蒸水溶解，原液濃度為1mg/m L，用常規實驗方法檢測TTX的LD50。先將1mg/m L的單抗(對照組用蒸餾水)注入小鼠腹腔，然后注入1.62μg/m L的TTX溶液，72h動態觀察并記錄小鼠的生存狀態。

1.2.5 TTX ELISA檢測方法的建立：以40μg/m L BSA-TTX包被酶標板，10%FCS PBS過夜封閉。將TTX用 PBS倍比稀釋后分別加入包被好的酶標板中，每孔50μL，再加入5μg/m L TTX-McAb每孔50μL，37℃ 1h，洗板后加入1：2000抗鼠二抗，37℃45m in后洗板TMB顯色，酶標儀測A450。

2 結果

2.1 TTX單克隆抗體的純化

用protein A sepharose CL 4B親和柱對所獲得的2株單抗腹水進行了純化，獲得了高純度的IgG如圖1所示。

圖1 TTX單抗的Protein A sepharose CL 4B純化結果1.穿透峰；2.洗脫峰Fig.1 Purification results of TTX McAb with protein A sepharose CL 4BNote：1.Transmission peak；2.Elution peak

2.2 純化后TTX單抗的SDS-PAGE鑒定

將protein A sepharose CL 4B親和柱純化的單抗體行 SDS-PAGE電泳，結果顯示抗體純度大于95%(圖2)。

圖2 2株TTX單抗純化后SDS-PAGE結果1.5E4，2.5E7，3.蛋白質Marker，a：重鏈，b：輕鏈Fig.2 SDS-PAGE results of purified TTX McAbs Note：1.5E4；2.5E7；3.Protein marker；a：Heavy chain；b：Light chain

2.3 純化后TTX單抗的間接EL ISA鑒定

用TTX-BSA以40μg/m L包被酶標板，常規間接ELISA檢測，結果顯示，單抗5E7的結合能力高于5E4(圖3)。

圖3 2株TTX單抗的活性檢測Fig.3 Detection of the activity of the anti-TTX McAbs

2.4 TTX單抗的中和活性測定

將2μg/m L濃度的TTX 0.5m L分別注入10只昆明小鼠腹腔后，小鼠于30m in內全部死亡；分別用2μg/m L、1.8μg/m L、1.6μg/m L、1.4μg/m L、1.48μg/m L、0μg/m L濃度的TTX測得 TTX的LD50為1.62μg/m L。將1mg/m L的TTX單抗(對照組用蒸餾水)0.5mL與1.62μg/mL TTX 0.5m L混合后注入小鼠腹腔，隨時觀察實驗和對照組(各10只)小鼠的狀況，24h后通過不斷追加2μg/m L TTX，每次0.2m L/只，每30min觀察1次，直至對照組小鼠全部死亡，測得當對照組小鼠全部死亡時，即2LD50時，TTX單抗對實驗小鼠的保護率為50%。

2.5 TTX的ELISA檢測結果

用中和性單抗與TTX競爭后加入酶標二抗，通過TMB顯色間接測定TTX濃度，從圖4可以看到，TTX濃度與顯色深淺成反比，競爭ELISA測得TTX的最小濃度為1.56μg/m L。

圖4 用競爭ELISA檢測TTXFig.4 Detection of TTX by competitive ELISA

3 討論

TTX是高毒的非蛋白神經性海洋生物毒素，人畜中毒死亡率高，目前尚無特效抗毒藥。TTX在軍事上也是潛在的化學戰劑和實施恐怖活動的毒劑。研制TTX的中和性抗體及檢測方法，在平時和戰時都具有重要的理論和現實意義。

TTX為氨基全羥基喹唑啉化合物，毒性強，分子量小，分子式為C11H17N3O8，主要通過阻滯鈉離子通道，阻斷神經肌肉電信號傳導，能夠引起肌肉麻痹和呼吸麻痹，導致人畜死亡［4-6］。作為典型的小分子半抗原(M r=319)，TTX本身無免疫原性。我們用甲醛將TTX與大分子的嗜孔血藍蛋白偶聯成TTX-KLH，免疫BALB/c小鼠，用TTX-BSA作為檢測抗原，通過將TTX與不同蛋白交聯，避免了非特異性免疫蛋白的干擾，取得了較好的免疫應答及檢測結果［7］。

昆明小鼠同時腹腔注射LD50劑量的TTX和抗TTX的單抗后，以TTX攻擊。結果表明，兩株單抗對染毒動物具有一定的保護效果，對2LD50及致死劑量TTX攻擊小鼠的保護率為50%，顯示出良好的抗毒效果。

用中和性抗體作為拮抗劑應用的一個最大問題就是，TTX分子量非常小，進入機體后能夠迅速作用于把靶器官，而與之相比，抗體分子量大，穿透力弱，與毒素的結合需要一個過程，要在短時間內阻斷毒素的作用具有一定難度。保護實驗結果充分說明了這一點，這也是今后其它小分子化合物毒素拮抗劑研究中所面臨的問題。

盡管如此，在目前TTX中毒無任何特效抗毒藥的情況下，我們的實驗結果無疑展現了希望。基于TTX的中和性抗體，我們建立了檢測 TTX的競爭ELISA方法，此方法檢測TTX的靈敏度為1.56μg/m L，與傳統ELISA的檢測靈敏度相比，仍具一定差距，需要進一步完善。鑒于TTX的小分子特性及與靶器官的快速結合，阻止其與鈉通道靶位結合的能力主要決定于親和力及拮抗劑分子量的大小。下一步的工作將是繼續研制高親和力的優質 TTX小分子拮抗劑，以便實現對TTX中毒的有效保護和急救治療；完善基于TTX中和性抗體的高靈敏度免疫檢測方法，對TTX的快速偵檢具有重要意義。

［1］Chang FC，Bauer RM，Benton BJ et al.4-Aminopyridine antagonizes saxitoxin-and tetrodotoxin-induced cardiorespiratory depression［J］.Toxicon.1996，34(6)：671-90.

［2］Chowdhury FR，Nazmul Ahasan HA，Mamunur Rashid AK，et al. Tetrodotoxin poisoning： a clinical analysis， role of neostigmine and short-term outcome of 53cases［J］.Singapore Med J.2007，48(9)：830-833.

［3］宮慶禮，崔建洲.河豚魚的安全食用研究［J］.衛生研究，2003，32(4)：346-348.

［4］Kao CY.Tetrodotoxin，saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomena.Pharmacol Rev［J］.1966，18(2)：997-1049.

［5］宋杰軍，毛慶武.海洋生物毒素學［M］.北京：北京科學技術出版社，1996：162-181.

［6］Chang FC， Benton BJ， Salyer JLet al. Respiratory and cardiovascular effects of tetrodotoxin in urethane-anesthetized guinea pigs［J］.Brain Res.1990，528(2)：259-268.

［7］Kawatsu K，Hamano Y，Yoda T et al.Rapid and highly sensitive enzyme immunoassay for quantitative determination of tetrodotoxin［J］.Jpn J Med Sci Biol.1997，50(3)：133-150.