Aβ25-35體外誘導海馬神經元及石菖蒲、遠志有效成分合用對其SOD、MDA的影響*

文 雯 王 玉

（浙江中醫藥大學生物工程學院，浙江 杭州 310053）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是發生于老年和老年前期以各種疾病引起的進行性、持續性高級神經功能的全面障礙，最終導致神經功能衰退的一組后天獲得性綜合征，是癡呆中最常見的一種［1］。為進一步探討α-細辛醚和遠志皂苷配伍的作用機制，本實驗體外培養大鼠海馬神經元，并用Aβ25-35體外誘導，建立了AD模型，檢測用藥前后海馬神經元超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的變化。

1 資料與方法

1.1 試劑及藥物 胰蛋白酶、DMEM高糖培養基、Neurobasal培養液、B27補充物、青霉素、鏈霉素（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；Aβ25-35、多聚賴氨酸（Sigma）；L-谷氨酰胺（杭州宏博進口分裝）；α-細辛醚標準品 （ALDRICH，2883-98-9）； 腦復康（石藥集團中諾藥業有限公司，批號：11100501）；遠志皂苷標準品（上海源葉生物科技有限公司，100908A）；阿糖胞苷（上海華聯制藥廠）。

1.2 大鼠海馬神經元的分離培養 取新生24 h內的SD大鼠（浙江省醫學科學院提供），在無菌條件下分離出雙側海馬，用0.25%胰蛋白酶消化 （37℃、20 min），加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基以終止消化，用巴斯德管將組織塊輕輕吹散，制成密度為2×105個/cm2的單細胞懸液，接種于涂有多聚賴氨酸的6孔板上，置于37℃、5%CO2的培養箱內培養。1 d后細胞貼壁，全部吸棄DMEM培養液，換為完全培養基（Neurobasal培養液加2%B27補充物、0.5 mmol/L L-谷氨酰胺、1%青、鏈霉素組成）。以后每周換液2次，每次換半液。于培養第4日在培養液中加入阿糖胞苷終濃度為10 μmol/L作用48 h以抑制膠質細胞的過度生長。經免疫熒光鑒定，通過細胞計數器統計，90%以上的細胞為神經元。培養第10日的神經元用于實驗。

1.3 海馬神經元AD模型的建立 選擇Aβ25-35片段，用三蒸水配制成100 μmol/L，過濾，分裝，-20℃凍存；使用前老化處理（將Aβ25-35溶解在DMSO中，再用DMEM稀釋，置于37℃下孵育7 d，即為老化狀態），并配制成所需濃度。加入濃度為20 μL（將Aβ25-35溶解在DMSO中，再用DMEM稀釋，置于 37℃下孵育 7 d，即為老化狀態）的 Aβ25-35，接觸 24 h，誘導建立AD細胞模型。

1.4 分組及與干預 取AD模型建立成功的神經元小皿，隨機分為模型組、腦復康組（加入腦復康注射液，終濃度為50 μmol/L）、α-細辛醚組（加入α-細辛醚標準品，終濃度為20 μmol/L）、遠志皂苷組（加入遠志皂苷，終濃度為 100 μmol/L），α-細辛醚聯合遠志皂苷組（加入α-細辛醚標準品終濃度為10 μmol/L、遠志皂苷終濃度為50 μmol/L）。另設空白組（正常海馬神經元）。

1.5 標本采集與檢測 取造模前后及治療前后海馬神經元進行形態學觀察。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD的含量，細胞上清液的取樣量為150 μL，檢測按試劑盒說明書操作，重復3次；采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定MDA的含量，細胞上清液的取樣量為0.2 mL，檢測按試劑盒說明書操作，重復3次。

1.6 統計學處理 應用SPSS11.0統計軟件。計量資料以（表示，采用單因素方差分析，再用SNK法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Aβ25-35誘導后對海馬神經元形態學的影響 新生大鼠海馬神經元分散培養10 d，神經元胞體增大，有明顯的折光性，立體感強，多數呈錐體狀或多極性，神經突起相互聯絡成網，細胞已具有成熟神經元的形態學特點。經Aβ25-35誘導，電鏡觀察部分神經元胞體出現腫脹，胞體增大，少數神經元胞體出現空泡，突起淡化、解離，神經元纖維呈簇狀。

2.2 石菖蒲、遠志對Aβ25-35誘導的海馬神經元MDA、SOD的影響 見表1。模型組MDA含量顯著高于空白組，且SOD活力明顯低于空白組（P＜0.05）；腦復康組、α-細辛醚組、遠志皂苷組、α-細辛醚聯合遠志皂苷組MDA含量均低于模型組且SOD活力明顯高于模型組（P＜0.05）；α-細辛醚聯合遠志皂苷組在降低MDA含量及提高SOD活性方面的效果顯著強于二者單用，差異具有統計學意義（P＜0.05或0.01）。

表1 各組細胞上清液中SOD、MDA含量比較（

表1 各組細胞上清液中SOD、MDA含量比較（

與α-細辛醚聯合遠志皂苷組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.05。

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3 討 論

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲的根莖，其味辛、苦，性微溫，可化痰開竅，補五臟、醒神明；遠志為遠志科植物遠志的根，其味苦辛，性微溫，具有寧心安神、祛痰開竅之功。石菖蒲常與遠志配伍以加強化痰開竅之功，成為古方治療癡呆、健忘的一個基本藥對。藥理學研究表明，石菖蒲對多種化學品造成的實驗動物記憶獲得障礙、記憶鞏固不良、記憶再現缺失、缺氧狀態均有明顯改善作用。另有研究表明，石菖蒲各提取部位均有促進學習記憶作用，但以其總揮發油中α-細辛醚和β-細辛醚的作用最明顯［4］。更有研究運用圓二色譜表征Aβ25-35二級結構的變化，結果表明石菖蒲水提取液及其揮發油一定時間內能夠有效地阻止了Aβ25-35由α-螺旋向β-折疊轉化，從而減少Aβ25-35的細胞毒性［5］。遠志皂苷可顯著拮抗Aβ對神經細胞的毒性作用，它能基本維持細胞的貼壁狀態，使漂浮細胞減少，突起伸展，細胞的存活數目較多，乳酸脫氫酶釋放量減少，對Aβ誘導的神經細胞損傷具有較好的保護作用［6］。

神經元受損時膜電子傳遞鏈的氧化還原狀態失衡以及AD的病理過程是產生大量的自由基［1-2］，自由基作用于脂質生物膜，使生物膜上的不飽和脂肪酸發生質脂過氧化反應，進一步影響膜結構和功能。中樞神經系統內含有大量的不飽和脂肪酸，易發生質脂過氧化反應，生成大量的脂質過氧化產物，因而測定脂質過氧化產物的穩定代謝物MDA的含量可反映組織自由基的含量和脂質過氧化程度。SOD是一種帶陰性電荷的金屬蛋白酶，是體內非常重要的氧自由基清除劑，它通過歧化方式清除超氧陰離子自由基。神經元受損時導致血-腦屏障開放，可使SOD進入到內皮細胞的胞漿和腦組織細胞外間隙，發揮清除超氧陰離子的作用。SOD是細胞內主要的對抗氧自由基的酶促抗氧化防御系統，SOD能使氧自由基在生理pH環境轉化成O2和H2O，脂質過氧化反應產物的增加可由自由基產生過多或其清除系統功能的喪失引起。

本實驗利用體外培養的海馬神經元經Aβ25-35誘導成功建立AD模型，體外模擬老年癡呆細胞損傷模型，檢測SOD、MDA含量。結果提示，過氧化反應增強是導致老化反應的重要因素；α-細辛醚和遠志皂苷均可明顯提高SOD活性和降低MDA含量，且α-細辛醚與遠志皂苷合用的效果明顯優于二者單用，說明α-細辛醚和遠志皂苷在清除自由基、抑制脂質過氧化方面具有協同作用，為二者在臨床上常相合為用提供了體外培養的實驗依據。

［1］ Nicoll JA，Wilkinson D，Holmes C，et al.Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide：a case report［J］.Nature Medicine，2003，9：448-452.

［2］ Hook VY，Reisine TD.Cysteine proteases are the major beta-secretase in the regulated secretory pathway that provides most of the betaamyloid in Alzheimer’s disease：role of BACE 1 in the constitutive secretory pathway［J］.J Neurosci Res， 2003，74(3)：393-405.

［3］ Kawahara M，Kuroda Y.Molecular mechanism of neurodegeneration induced by Alzheimer’s beta-amyloid protein： channel formation and disruption of calcium homeostasis［J］.Brain Res Bull，2000，53：389-397.

［4］ Lin H.Amyloid beta protein forms ion channels：implications for Alzheimer’s disease pathophysiology［J］.FASEB J，2001，15：2433-2445.

［5］ Troy CM，Rabacchi SA，Friedman WJ，et al.Caspase-2 mediates neuronal cell death induced by beta-amyloid［J］.J Neurosci，2000，20(4)：1386-1392.

［6］ Tsuruda T，Costelloboerrigter LC，Burnett Jr JC.Matrix metalloproteinases： pathways of induction by bioactive molecules［J］.Heart Fail Rev，2004，9(1)：53-61.