姜黃素誘導人胃癌MGC-803細胞凋亡的機制

丁 峰 楊 夙 王 巍 孫宏治 白 光 (遼寧醫學院附屬第一醫院普外科，遼寧 錦州 200)

姜黃素誘導人胃癌MGC-803細胞凋亡的機制

丁 峰 楊 夙1王 巍 孫宏治 白 光 (遼寧醫學院附屬第一醫院普外科，遼寧 錦州 121001)

目的通過體外實驗探討姜黃素誘導人胃癌MGC-803細胞凋亡的作用機制。方法取人胃癌細胞系MGC-803培養至對數生長期，按姜黃素作用的不同濃度分組:3.12、6.25、12.5、25.0、50.0μmol/L，作用的不同時間分組:24、48、72 h，采用四甲基耦氮唑藍(MTT)計算細胞抑制率;應用吖啶橙熒光染色觀察細胞的形態學改變;流式細胞儀檢測細胞周期的變化;使用瓊脂糖凝膠電泳觀察細胞DNA片段化作用。結果(1)利用MTT比色分析法，發現MGC-803細胞分別用含不同濃度姜黃素溶液培養24、48、72 h后，細胞增殖受到明顯的抑制，且與濃度和時間呈正相關;(2)通過吖啶橙染色發現，在姜黃素作用下，部分細胞明顯變圓，體積縮小，熒光增強，核染色質固縮，呈新月形、腎形在核膜周邊聚集;(3)流式細胞儀分析結果顯示，姜黃素主要使細胞周期阻滯于S期，G1期細胞數減少，G2/M期細胞數變化不明顯;(4)DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，12.5、25.0、50.0μmol/L濃度處理組作用48 h后出現典型的DNA斷裂的梯子樣外觀。結論姜黃素能明顯抑制人胃癌細胞MGC-803的增殖并誘導凋亡，其作用機制可能與細胞的S期阻滯有關。

姜黃素;胃癌;凋亡;

姜黃素(Curcumin，Cur)是從姜科姜黃屬植物姜黃、郁金等植物的根莖中提取的一種天然有效成分，具有抗氧化、抗炎癥反應、抗動脈粥樣硬化、降血脂等多種作用，對多種腫瘤具有明顯的生長抑制而無致突變作用，由于其獨特的作用機制且“高效低毒”的優點，已成為近年來抗腫瘤藥物中最受重視的一類新藥〔1〕。本實驗旨在探討Cur對人胃癌細胞系MGC-803的增殖抑制作用以及作用的量效、時效關系，通過形態學、細胞周期的改變、活化蛋白的表達等相關指標，研究其作用機制，從而為臨床使用Cur治療胃癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 RPMI-1640培養基、胎牛血清和胰蛋白酶(美國Gibco公司);糖酸酶(RNase)、碘化丙啶(PI)、100 bp DNA ladder和凝膠儲備液(華美生物試劑公司)。流式細胞儀:FACSCalibur，美國;數顯氣浴恒溫振蕩器:CHA-SA，江蘇;酶聯免疫檢測儀:DJ3022A，上海;Bio-rad半干轉印儀:德國。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人MGC-803細胞在完全培養基(RPMI-1640培養基90%體積分數、胎牛血清10%、青霉素100 U/ml、鏈霉素100μg/ml)中培養至對數生長期，0.25%胰蛋白酶消化至胞質回縮、細胞間隙增大時倒出胰蛋白酶，加入胎牛血清終止消化，離心，記數1×105/ml細胞密度。MTT法測細胞成長抑制率:取對數生長期的MGC-803細胞，消化、計數，調整密度為1×105/ml接種于96孔培養板，每孔100μl。每組分別設4個復孔，細胞貼壁生長24 h后，更換實驗用培養液。分別培養24、48、72 h，實驗組加入含不同濃度Cur的培養液，終濃度為3.12、6.25、12.5、25、50 μmol/L，對照組加入等量 RPMI-1640 培養液。酶聯免疫檢測儀測量吸光度(OD)值(以DMSO作空白對照調零)，與對照組比較，計算各組細胞生長抑制率。生長抑制率(%)=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 吖啶橙(AO)染色觀察 預先根據24孔培養板孔徑大小，將蓋玻片剪成所需的小蓋片，消毒后置于24孔培養板孔內備用。取對數生長期的MGC-803細胞，消化、計數，調整密度為1×105/ml，接種于24孔培養板，每孔500μl進行單層蓋片培養。培養24 h后，更換培養液。實驗組加入含不同濃度Cur的培養液。對照組加入等量RPMI-1640培養液，繼續培養48 h。熒光顯微鏡下觀察細胞形態及顏色并照相。

1.2.3 流式細胞儀分析細胞周期變化 取對數生長期MGC-803細胞，消化、計數，調整密度為1×105/ml。6孔培養板每孔接種量2 ml，37℃培養24 h后更換實驗用培養液。實驗組加入含不同濃度Cur的培養液，作用24、48 h后分別終止培養，對照組加入等量RPMI-1640培養液。用流式細胞儀分析標本，分析采用Nicolletri法。汞激發激光波長為488 nm，15 mV，分析軟件為 Cellquest和Modfit LI for Machitash V 3.0。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞，消化、計數，調整密度為1×105/ml。每個培養瓶接種量4 ml，37℃培養，24 h后更換實驗用培養液。實驗組加入含不同濃度Cur的培養液，作用于48 h后分別終止培養，對照組加入等量RPMI-1640培養液。收集以上細胞及對照組細胞，1 000 r/min，離心5 min，棄培養液，PBS洗兩次，棄上清;再加入1 ml PBS重懸細胞，移入1 m l微量離心管中1 000 r/min，離心5 min棄上清。加入50μl細胞裂解液，混勻，于37℃水浴恒溫至混合物變得清亮;在高速冷凍離心機中，室溫12 000 r/min，10 min，將上清液轉移至另一潔凈的微量離心管中。以等體積的苯酚/氯仿(1∶1)，苯酚/氯仿/異丙醇(25∶24∶1)和氯仿各抽提一次;在上清中加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉和2倍體積的冷乙醇，于－20℃沉淀過夜;在 －20℃，12 000 r/min離心10 min，收集并將沉淀溶入20μl TBE緩沖液，加入1μl RNA酶，37℃保溫1 h。加入4μl樣品緩沖液，混勻，立即加到含有0.4μg/ml溴化乙錠的1% ～2% 瓊脂糖凝膠的樣品中，室溫，于1倍TBE緩沖液中5 V/cm電壓下電泳1～2 h，紫外分析儀觀察實驗結果并拍照。以標準品100 bp DNA ladder為對照。

1.3 統計學分析 采用SPSS11.0軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 MTT實驗結果 不同濃度的Cur(3.12、6.25、12.5、25.0、50.0μmol/L)處理細胞24、48、72 h后對照組與實驗組不同濃度的Cur不同時點對MGC-803的抑制率見表1。各組細胞形態變化見圖1。鏡下可見對照組細胞貼壁生長緊密，生長情況良好，細胞呈梭形或多邊形，細胞透明，折光性好，狀況佳。中等劑量組(12.5μmol/L)細胞形態欠規則，細胞間隙增大，胞漿內變化不明顯或略有變化，死亡細胞增多。大劑量組(50.0μmol/L)細胞形態不規則，大部分細胞漂浮于細胞培養液中，并可看到壞死細胞和碎片，有的細胞內可看到黑色顆粒物質。

2.2 AO染色實驗 活細胞經過AO染色以后，在電子熒光顯微鏡下細胞的形態不發生改變，細胞核DNA為黃色或黃綠色均勻發光，細胞質為橘黃色或橘紅色熒光。當出現凋亡細胞時，會出現明顯變化。實驗組與對照組均在電子熒光顯微鏡下經BV濾片激發，可觀察到對照組細胞形態規則，細胞核圓型，核DNA呈現黃色或黃綠色均質熒光，胞漿為橘黃色均質熒光;實驗組出現凋亡細胞，表現為細胞體積縮小、變圓，核仁內出現黃綠色碎片，細胞核呈新月形或腎型。見圖2。

表1 不同濃度的Cur在不同時間對MGC-803的抑制率(n=4，±s，%)

表1 不同濃度的Cur在不同時間對MGC-803的抑制率(n=4，±s，%)

與對照組比較:1)P﹤0.01;不同時間組之間比較:2)P﹤0.01;實驗組內兩兩比較:3)P﹤0.01

組別 劑量(μmol/L)24 h 48 h 72 h對照組0 0.407±1.47 1.055±1.93 1.231±1.39實驗組 3.12 8.181±1.171)2)3)14.26±2.221)2)3)20.73±2.191)2)3)6.25 11.23±2.431)2)3)21.66±3.641)2)3)34.68±3.431)2)3)12.5 23.38±1.971)2)3)35.02±3.271)2)3)41.55±2.771)2)3)25.0 36.43±3.111)2)3)48.23±3.121)2)3)51.53±3.521)2)3)50.0 44.03±2.281)2)3)53.66±1.781)2)3)60.36±3.251)2)3)

圖1 各組細胞的形態變化

2.3 流式細胞儀分析細胞周期變化 對照組和不同濃度Cur組(12.5、25.0、50.0 μmol/L)作用細胞 24 h，細胞周期出現顯著變化，G0/G1期細胞數由80.37%降低到42.62%，S期由7.36%升高到37.43%，而G2/M期變化不明顯;隨著藥物作用濃度的增加，G0/G1期細胞數逐漸減少，S期細胞數逐漸增加，各濃度細胞數與對照組比較都有顯著差異(P＜0.05)，不同濃度間比較也具有顯著性差異。見表2，表3。

圖2 各組細胞凋亡情況

表2 不同濃度Cur作用24 h細胞周期的變化(n=3，±s，%)

表2 不同濃度Cur作用24 h細胞周期的變化(n=3，±s，%)

與對照組比較:1)P﹤0.05;實驗組內兩兩比較:2)P﹤0.05;下表同

組別 劑量(μmol/L)G0/G1期 S期 G2/M期對照組0 80.37±1.69 7.36±1.17 19.19±1.37實驗組 12.5 64.24±2.121)2) 16.37±1.621)2) 20.39±1.031)2)25.0 54.36±1.041)2) 23.36±1.891)2) 22.01±2.021)2)50.0 42.62±1.111)2) 37.43±1.061)2) 19.95±1.221)2)

表3 不同濃度Cur作用48 h細胞周期的變化(n=3，±s，%)

表3 不同濃度Cur作用48 h細胞周期的變化(n=3，±s，%)

組別 劑量(μmol/L)G0/G1期 S期 G2/M期對照組0 73.29±2.21 8.52±2.04 18.46±1.62實驗組 12.5 60.37±2.121)2) 18.37±1.651)2) 21.26±1.141)2)25.0 51.22±1.271)2) 28.24±2.021)2) 20.54±1.311)2)50.0 38.23±2.011)2) 44.46±1.691)2) 17.31±2.231)2)

2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡 見圖3。不同濃度的Cur(12.5、25.0、50.0 μmol/L)作用MGC-803 細胞48 h，在 DNA電泳圖上可以看到典型的“梯子”形條帶，隨著作用藥物濃度增加，條帶逐漸清晰;對照組停留在加樣孔附近，呈單一條帶。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳結果

3 討論

胃癌是源自胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，占胃惡性腫瘤的95%，在我國發病率很高，死亡率占惡性腫瘤的第一位。因其臨床起病隱匿、發展迅速，確診時多屬晚期，手術切除率僅為20% ～30%左右;而且，術后有2/3以上臨床復發，大多數還有轉移。近年來，隨著對腫瘤生物學特性認識的提高及化療新藥的不斷推出，國內外關于化療的研究越來越多，化療作為腫瘤綜合治療的重要輔助手段日益受到關注，人們希望通過全身治療來消滅局部殘留的腫瘤細胞及微小轉移病灶，以治愈或延長患者的生存期。因此，化療被認為是胃癌輔助治療的重要手段之一〔1〕。

細胞凋亡(apoptosis)又稱細胞程序性死亡(PCD)，是由基因調控的細胞自主的有序性死亡，其生理功能在于保持組織器官中正常細胞增殖和死亡數量的動態平衡。其通過激活細胞自身的“死亡裝置”而啟動、執行，所謂“死亡裝置”就是指細胞內專門負責細胞凋亡信號的感應、調控、執行的一整套分子程序。傳統的腫瘤治療觀念是藥物直接作用于核酸、微管蛋白和其他靶點來殺傷腫瘤細胞，隨著對凋亡研究的逐步深入，人們逐漸認識到藥物除通過各自的靶點直接作用外，也可以通過誘導細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞。腫瘤細胞凋亡敏感性可能是影響化療效果的關鍵因素，因此，能否誘導凋亡已成為篩選抗癌藥物的標準之一，如何誘導凋亡也成為新的研究目標〔2〕。

Cur是最近幾年被發現的具有抗腫瘤作用的一種植物單體，研究表明Cur在體外對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，在體內實驗中也顯示有較好的抑制作用，體內與體外實驗結果具有一定的相關性〔3〕。也有文獻報道，Cur可顯著抑制腫瘤細胞拓撲異構酶 I的活性〔4，5〕。沃興德等〔6，7〕以人口服劑量的600倍做一次性最大耐受量實驗，所觀察各項指標均正常，未看到1只小鼠死亡，證明Cur無明顯的急性毒性作用。腫瘤細胞的無限制快速增殖是其重要特征之一，抑制腫瘤細胞增殖是控制腫瘤的一條途徑。近年來研究發現Cur在體內、外具有抑制腫瘤細胞增殖的作用。Khafif等〔8〕報道Cur在體內對小鼠肝癌H22、裸鼠移植人OS-732、HCT-8也顯示出較好的抑制作用，并且隨藥物濃度增大抑制率逐漸增大，呈量效依賴關系。Fujiki等〔9〕的研究也證實了Cur有顯著的抑制腫瘤細胞增殖的作用，并認為Cur的抗腫瘤作用與刺激TNF-α的釋放有關。

本實驗證明，Cur可以顯著抑制MGC-803細胞的增殖，增殖抑制作用呈時間-濃度依賴關系，與文獻〔10〕報道一致。本實驗中所取最大作用濃度為50.0μmol/L，因此對于是否隨著藥物濃度的繼續增加，其抑制作用更加顯著尚不能肯定，需要在以后的相關實驗中加以證實。

細胞周期又稱細胞增殖周期，包括G1、S、G2、M期。所有增殖細胞均經過同一類似周期，腫瘤細胞的增殖過程同樣要經過分裂的各個時期。細胞周期正常與否與細胞的生長、分化、衰老和癌變密切相關。Lin等〔11〕認為，腫瘤發生的根本原因在于基因組不穩定，使本來應停止增殖的或生理性凋亡的細胞不停地進入細胞周期，因而造成惡性增生。目前很多學者發現許多抗腫瘤藥物能夠影響腫瘤的細胞周期分布，任何一個時相的生物合成被阻斷，都可以使整個增殖周期被中斷。Lowe等〔12〕體外對肝癌細胞MKN-28研究報道，Cur可使其阻滯于S期，并可誘導其發生凋亡。Hecht等〔13〕通過流式細胞技術分析Cur對宮頸癌細胞HeLa的影響，結果顯示Cur阻滯宮頸癌HeLa細胞于S期，阻止腫瘤細胞向G2期發展，并誘導細胞凋亡。

AO染色實驗結果顯示，Cur主要阻滯胃癌細胞MGC-803于S期;S期正是DNA合成時期，說明Cur可能有干擾腫瘤細胞核酸合成作用。根據Hecht的報道Cur有特異性抑制拓撲異構酶I的作用，所以推測抑制拓撲異構酶I的作用進而干擾核酸合成可能是Cur抑制腫瘤細胞于S期的機制之一。但其確切的機制尚未完全闡明，有待進一步深入研究。

瓊脂糖凝膠電泳是鑒定細胞凋亡生物化學指標中最具特征性的手段之一，尤其適用于體外培養的均一細胞系〔14〕。細胞凋亡時染色體斷裂形成大約180～200 bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段，瓊脂糖凝膠電泳就是將這些DNA片段從細胞中提取出來，紫外燈下觀察可見特征性的“梯狀”帶。而壞死細胞DNA的降解是隨機的，電泳所見為類似血涂片的連續性改變(diffuse smear)〔15〕。正常細胞則無 DNA降解，分子量大，走行緩慢，故表現為停留在加樣孔附近的單一條帶。本次實驗中就是把Cur作用48 h后實驗組與空白對照組細胞上機檢測，空白對照組停留在加樣孔附近，呈單一的條帶，說明對照組細胞無DNA的降解;實驗組則可以看到“梯子”樣條帶，并隨著藥物作用濃度的增加條帶變寬、變亮，大小為100 bp及其整數倍，說明在該處理因素下發生凋亡，且與藥物作用濃度正相關。

綜上所述，本實驗證明Cur能明顯抑制體外培養的MGC-803細胞的生長、增殖，并呈時間-劑量依賴關系;Cur的抗增殖作用主要是通過將MGC-803細胞阻滯于S期和誘導其凋亡來實現的，且細胞凋亡與S期的阻滯關系密切。

1 袁世珍，黃潔夫.胃癌〔M〕.上海科學技術出版社，2001;2(3):1-5.

2 王樹濱，楊純正.腫瘤化療藥物誘導細胞凋亡的研究進展〔J〕.癌癥，2000;19(12):1173-6.

3 安繼紅，陳 鵬，辛秀芹.姜黃素體外抗腫瘤作用的觀察〔J〕.實用臨床醫藥雜志，2007;11(2):24-5.

4 范 鈺，張尤歷，許則豐.姜黃素抑制結腸癌620細胞侵襲的體外實驗研究〔J〕.江蘇大學學報(醫學版)，2006;16(4):298-300.

5 丁志山，高承賢，陳鈮鈹，等.姜黃素具有抑制血管生成與誘導腫瘤細胞凋亡雙重作用〔J〕.中國藥理學通報，2003;19(2):171-3.

6 沃興德，洪行球，高承賢.姜黃素長期毒性試驗〔J〕.浙江中醫學院學報，2000;24(1):61.

7 沃興德，洪行球，高承賢.姜黃素最大耐受量試驗〔J〕.浙江中醫學院報，2000;24(2):55.

8 Khafif A，Schantz SP，Chou TC，et al.Quantitation of chemopreventive synergism between epigallocatechin gallate and curcum in normal，premaligant and maligant human oralepithelial cells〔J〕.Carcinogenesis，1998;19(3):419-24.

9 Fujiki H，Suganuma M，Kurusu M，et al.New TNF-alpha releasing factors as cancer preventive agents from traditional herbalmedicine and combination cancer prevention study with EGCG and sulindac or tamoxifen〔J〕.Mutat Res，2003:523-4.

10 Hanif R，Qiao L，Shiff S，et al.Curcumin，a natural plant phenolic food additive，inhibits cell proliferation and induces cell cycle changes in colon adenocarcinoma cell lines by a prostaglandin-independent pathway〔J〕.JLab Clin Med，1997;130:576-84.

11 Lin JK，Lin-Shiau SY.Mechanisms of cancer chemoprevention by curcumin〔J〕.Proc Natl Sci Counc ROC(B)，2001;25:59-66.

12 Lowe SW，Perraul AR，Iliakis G，et al.Down-regulation of DNA replication in Corilagin-treated cells:activation of an S-phase checkpoint?〔J〕.Cancer Res，1997;57:1654-9.

13 Hecht SM，Berry DE，MacKenzie LJ，et al.A strategy for identifying novel，mechanistically unique inhibitors of topoisomerase I〔J〕.Nat Prod，1992;55(4):401-13.

14 趙振軍，張麗杰，易小兵，等.幾種凋亡細胞檢測方法的比較〔J〕.醫學綜述，2003;9(7):387-9.

15 矯毓娟，劉江紅.細胞凋亡的檢測方法〔J〕.中國神經免疫學和神經病學雜志，2004;11(1):53-6.

R735.2

A

1005-9202(2012)12-2549-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.048

遼寧省科技廳科學計劃項目(No.2010225034)

1 遼寧醫學院附屬第三醫院消化內科

白 光(1960-)，男，主任醫師，教授，主要從事肝膽疾病基礎與臨床研究。

丁 峰(1981-)，男，碩士，醫師，主要從事肝膽疾病基礎與臨床研究。

〔2011-10-15收稿 2012-01-27修回〕

(編輯 袁左鳴)