豹皮樟總黃酮調控瘦素、TGF-β1對肝纖維化大鼠的預防作用研究

黃 成，馬陶陶，李 浩，李政通，章勝朋，鄧子煜，李 俊

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽天然藥物活性研究省級重點實驗室，國家中醫藥管理局中醫藥三級實驗室“中藥藥理實驗室”，安徽合肥 230032;2.安徽醫科大學第二附屬醫院，安徽合肥 230601)

肝纖維化是肝臟對于各種慢性損傷的修復反應，以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在肝臟內大量沉積為病理特征。瘦素(leptin)是肥胖基因編碼的肽類激素，具有重要的生理作用。研究顯示，瘦素參與肝纖維化的形成，瘦素致纖維化的機制與轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)密切相關［1－2］。豹皮樟總黃酮(total flavonoids of Litsea coreana Levl，TFLC)是從藥食同源植物豹皮樟提取的有效部位。前期研究表明，TFLC具有良好的抗炎和免疫調節作用，對酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎均具有較好的防治作用［3－4］，對肝纖維化大鼠具有治療作用［5］。本實驗將在前期研究的基礎上，進一步研究TFLC對CCl4誘導肝纖維化大鼠的預防作用，并深入探討TFLC對瘦素、瘦素受體(leptin receptor，Ob-Rb)及TGF-β1/Smads通路蛋白表達的影響，為TFLC防治肝纖維化提供實驗和理論依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑 豹皮樟總黃酮，由本院天然藥物化學室研制，總黃酮含量＞70%;秋水仙堿購于版納藥業有限公司，臨用前均以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成相應濃度的混懸液。CCl4，分析純，購于汕頭西隴化工廠，臨用前用花生油1∶1稀釋。谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、 羥 脯 氨 酸(hydroxyproline，Hyp)測定試劑盒購于南京建成生物科技公司。透明質酸(hyaluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原氨端肽(procollagenⅢN-terminal peptide，PⅢNP)、Ⅳ型膠原(procollagenase IV，CⅣ)放免試劑盒購于北京北方生物技術研究所。Ⅰ型膠原(collagenⅠ)、TGF-β1、leptin ELISA試劑盒購于上海森雄科技實業有限公司。TRIzol Reagent購于Invitrogen公司。Reverse Transcription System逆轉錄試劑盒與PCR試劑盒購于Fermentas公司。Ob-Rb、TGFβ1Ⅰ型受體(TGFβR1)、Smad3、β-actin引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。小鼠抗Ob-Rb、TGFβR1、Smad3抗體購于美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標記二抗購于北京中杉公司;ECL發光試劑盒購于Pierce公司。

1.2 實驗動物 ♂SD大鼠，體質量200～220 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供(動物合格證號:皖醫實動準字第01號)。動物自由進食、飲水，1周后使用。

2 方法

2.1 動物分組與處理 大鼠正常喂養1周后，隨機分為正常組、模型組、給藥組(低劑量組100 mg· kg－1、中劑量組200 mg·kg－1、高劑量組400 mg· kg－1)，每組10只。除正常組外，其余各組每周二、周五皮下注射50%CCl4花生油溶液(1 ml·kg－1)，連續12周;正常組皮下注射等量的花生油溶液。給藥組于造模第1周起灌胃給予TFLC，每天1次，直至造模結束;正常組和模型組灌以等量的生理鹽水。第12周末，大鼠禁食12 h，2%戊巴比妥鈉(30 mg· kg－1)麻醉，腹主動脈采血，常規制備血清;留取肝臟組織標本，檢測相關指標。

2.2 血清學指標檢測 大鼠取血后室溫靜置1 h，3 000 r·min－1離心15 min，分離血清。檢測血清中ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ及Ⅰ型膠原、瘦素、TGF-β1。

2.3 組織學指標檢測 肝組織石蠟切片Masson染色觀察形態學改變，制備肝勻漿，檢測肝組織Hyp含量。

2.4 RT-PCR分析Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3的mRNA水平 按TRIzol試劑盒說明書，提取肝臟組織總RNA，按RT-PCR試劑盒說明書，逆轉錄合成cDNA。引物序列見Tab 1。以β-actin為內參照。PCR反應產物置1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。凝膠成像系統進行密度掃描，以各擴增產物對β-actin光密度值的比值表示目的基因的相對量。

2.5 Western blot檢測肝組織中 Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3蛋白水平 取大鼠肝組織100 mg，加入1 ml RIPA組織裂解液(每ml裂解液中加10 μl PMSF)，冰上進行組織勻漿，12 000 r·min－1，4℃，離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。每孔加樣量為20 μg蛋白(濃縮膠電壓80 V，分離膠100 V)。電泳結束后由半干轉儀器將蛋白轉移到PVDF膜上，電壓20 V，時間15 min。膜于室溫下以含50 g ·L－1脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，漂洗后加入一抗(Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3)，4℃過夜。再分別加入與一抗相匹配的二抗，室溫放置1 h。ECL發光試劑盒顯影，以β-actin為內參，分析條帶吸光值。

2.6 統計分析 采用SPSS 13.0進行單因素方差分析及t檢驗處理，等級資料采用非參數秩和檢驗，結果以±s表示。

3 結果

3.1 TFLC對 CCl4誘導的肝纖維化大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型膠原及肝組織Hyp的影響 模型組血清ALT、AST水平與正常組比較明顯增加(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg· kg－1)明顯降低模型大鼠血清ALT、AST水平(P＜0.05，P＜0.01)，表明TFLC具有肝臟保護作用(Fig 1a);模型組血清肝纖維化指標HA、LN、PⅢNP、CⅣ、CollagenⅠ及肝組織中Hyp與正常組比較明顯增加(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg·kg－1)明顯降低模型大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ、CollagenⅠ及肝組織Hyp水平(P＜0.05，P＜0.01)，見Fig 1b、c、d、e;以上實驗結果表明，TFLC對肝損傷及肝纖維化大鼠具有預防作用。

3.2 TFLC對CCl4誘導的肝纖維化大鼠病理形態學影響 Masson染色結果顯示，正常組肝組織結構完整，肝細胞排列整齊;模型組肝組織有大量膠原纖維沉積，纖維間隔粗大，形成假小葉;TFLC(200、400 mg·kg－1)明顯減輕纖維沉積，纖維間隔變窄，表明TFLC可明顯降低肝纖維化程度(Fig 2)。

Tab 1 Sequences of the primers used in the PCR measurements

3.3 TFLC對 CCl4誘導的肝纖維化大鼠血清Leptin、TGF-β1的影響 模型組瘦素和TGF-β1含量明顯增加(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg·kg－1)明顯降低模型大鼠血清瘦素和TGF-β1的含量(P＜ 0.05，P＜0.01)，見Fig 3a、b。

Fig 1 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on serum alanine transaminase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)，hyaluronic acid(HA)，laminin，procollagenⅢN-terminal peptide(PⅢNP) and procollagenase IV(CIV)，hydroxyproline，Collagen Ι and liver Hyp contents in liver fibrosis rats.Each group consists of 10 rats(ˉx± s)

Fig 2 Photomicrographs of liver sections stained with Masson's trichrome(×200)

3.4 TFLC對CCl4誘導的模型大鼠Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mRNA與蛋白表達的影響 與正常組相比，模型組肝組織中Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mR-NA及蛋白表達均明顯增高(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg·kg－1)可明顯降低上述各項指標 (P＜0.05，P＜0.01)，見Fig 4。表明TFLC預防肝纖維化機制可能與降低Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3表達有關。

Fig 3 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on serum Leptin and TGF-β1 level in liver fibrosis rats.Each group consists of 10 rats(±s)

Fig 4 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on Ob-Rb，TGF-βR1，Smad3 mRNA and protein level in liver fibrosis rats.mRNA and protein are corrected by β-actin(±s)

4 討論

肝纖維化以ECM的過度沉積為特征。膠原蛋白、蛋白多糖、非膠原性糖蛋白是構成ECM的3大類物質［6］。HA是構成ECM中蛋白多糖的主要成分，LN為一種重要的糖蛋白，PⅢNP與肝纖維化的程度呈定量的明顯相關關系，CⅣ可反映肝細胞損傷、纖維化程度;Hyp為膠原蛋白特有的氨基酸，在肝組織其含量可反映膠原增生與纖維化程度，Ⅰ型膠原是構成膠原蛋白的重要成分［7－8］，以上指標聯合檢測對肝纖維化具有重要診斷價值。本研究中，CCl4誘導肝纖維化大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型膠原及肝組織Hyp明顯升高，TFLC(200、400 g ·L－1)可明顯降低血清中升高的HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型膠原及肝組織中Hyp水平;病理形態學檢測發現，TFLC(200、400 mg·kg－1)明顯減輕纖維沉積，纖維間隔變窄;以上實驗結果表明，TFLC能夠有效預防CCl4誘導的大鼠肝纖維化。

研究證實:活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝纖維化ECM的主要來源細胞。HSC的活化、增殖是肝纖維化的關鍵事件，這一復雜的病分子網絡共同調控的結果，TGF-β1是其必需的調節因子［9］。在TGF-β1細胞內信號傳導通路中，Smad蛋白為關鍵的信號傳導分子。研究顯示:動物肝纖維化往往伴隨血清及組織TGF-β1增加，HSC數量進行性增多，Smad3表達明顯增高。在纖維化形成過程中，瘦素可上調TGF-β1。瘦素具有細胞因子特性，與細胞表面的瘦素受體結合發揮生物學作用［10］。Honda等［11］在研究瘦素缺陷的小鼠(ob/ ob)和天然瘦素受體缺陷大鼠(fa/fa)發現，肝纖維化明顯被抑制，肝臟α1(Ι)前膠原mRNA表達明顯降低，而且肝內TGF-β1和HSC活化也被抑制;如果補充瘦素至生理水平，ob/ob小鼠可出現明顯的肝纖維化，并且肝內TGF-β1水平、α1(Ι)前膠原mRNA水平也明顯提高;Leclercq等［12］的研究也得出同樣的結果。提示瘦素可上調TGF-β1水平增強肝纖維化的形成［13］。本實驗發現，在CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中，外周血瘦素和TGF-β1含量增高;肝組織中Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mRNA及蛋白表達增強;而TFLC對模型大鼠外周血瘦素、TGF-β1含量及組織中TGF-βR1、Smad3、瘦素受體的表達有明顯的降低作用。以上結果表明，TFLC預防肝纖維化的作用機制可能與下調瘦素及其受體，抑制TGF-β1/Smad通路有關。

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